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气孔是植物与大气间进行气体交换的主要通道,控制着光合作用原料CO2的进入和光合产物O2的释放,同时它也是蒸腾作用中水分散失的主要通道,在植物自体平衡中起到极其关键的作用。近来一系列研究表明,5-氨 基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)能够抑制黑暗、ABA、H202等因素诱导的叶片气孔关闭,而且证明,这一效应与其诱导保卫细胞黄酮醇积累、H2O2和胞质Ca2+含量降低有关,但更进一步的机制尚不明确。细胞骨架成分之一的微管,在保卫细胞中从腹壁到背壁呈辐射状排列。研究表明其对光照敏感,且可能与气孔开闭有关。此外,蛋白质可逆性磷酸化是细胞信号转导通路的重要环节。其中,PP2C蛋白磷酸酶在ABA信号通路中作为负调控因子起作用,但是,我们的预试验结果表明,PP2C并不参与ALA抑制ABA诱导的气孔关闭。相反,另一种蛋白磷酸酶PP1/PP2A可能参与该调节过程。因而,我们利用微管特异性药剂及磷酸酶专一性抑制剂来探究微管、PP1/PP2A在ALA-ABA调控的气孔运动中的关系,以阐明ALA调控植物叶片气孔运动机制,为其在农业生产中应用提供理论依据。现将主要结果介绍如下:1.以富士苹果(Malus domenstica cv.Fuji)叶片下表皮为材料,利用外源微管解聚剂长春碱(Vinblastine,VBT)和微管稳定剂紫杉醇(Taxol)处理,可以影响ALA和ABA对苹果叶片气孔运动的调节作用。qRT-PCR研究发现,ALA上调微管相关基因如TUB1、MAP65-1和MAP65-6表达,并逆转ABA对TUB1表达的抑制。另一方面,PP1/PP2A蛋白磷酸酶活性抑制剂冈田酸(OA)能引起气孔关闭,并削弱ALA抑制ABA诱导的气孔关闭能力;而Taxol和VBT分别缓解和加剧OA对气孔开度的抑制。此外,OA还能促进保卫细胞H2O2积累,且在其下游伴随着微管解聚。以上结果表明,ALA可以通过促进苹果叶片保卫细胞PP1/PP2A蛋白磷酸酶活性,抑制ABA诱导产生H202,进而促进微管相关基因表达和微管聚合,最终抑制ABA诱导的气孔关闭,从而为苹果叶片光合气体交换打开气孔通道。2.为了验证苹果上获得的工作假说,我们以GFP-α-tubulin-6拟南芥子叶为材料,研究了微管在ALA-ABA调控气孔运动中的作用。在光照条件下,ABA或VBT处理导致微管解聚,气孔开度减小。而ALA或Taxol通过抑制微管解聚,阻制了 ABA或VBT诱导的气孔关闭。说明微管的解聚与聚合参与了 ALA-ABA调控气孔运动过程。ALA处理促进保卫细胞微管聚合,从而抑制ABA诱导的叶片气孔关闭。3.以野生型、PP2A-C2过表达株系OE、T-DNA插入突变体pp2a-c2及GFP-α-tubulin-6拟南芥子叶为材料,研究ALA对PP1/PP2A活性的影响及其与保卫细胞微管的相互关系。结果显示:①OA能削弱ALA对气孔开度的促进作用,也削弱ALA对ABA诱导气孔关闭的抑制作用,说明PP1/PP2A参与了 ALA-ABA调节的气孔运动;②外源ALA诱导编码PP2A的大部分基因表达增强,同时逆转了 ABA对PP2A-C2、PP2A-C5、PP2A-B’γ及PP2A-B’δ基因表达的抑制效应,说明ALA通过上调PP2A催化亚基和调节亚基基因表达来促进PP2A活性;③在突变体pp2a-c2中,ALA抑制ABA诱导的气孔关闭效应被显著削弱,而在OE中结果相反,说明PP2A-C2基因参与了 ALA抑制ABA诱导气孔关闭过程;④OA促使微管解聚,气孔开度减小;而Taxol和VBT分别缓解和加剧了 OA诱导的微管解聚和气孔关闭,说明PP1/PP2A在微管上游起作用。酶活性受抑,将导致微管解聚。以上结果表明,ALA通过增强PP1/PP2A活力来促进微管聚合,抑制ABA诱导的气孔关闭,且主要上调PP2A催化亚基基因和调节亚基基因如P2A-C2、PP2A-B’γ等基因的表达来提高酶活力。4.以野生型、OE、pp2a-c2突变体及GFP-α-tubulin-6拟南芥子叶为材料,研究PP1/PP2A、ROS以及微管在ALA-ABA调控气孔运动中的相互关系。结果显示:①在OA处理下,或在pp2a-c2突变体中,保卫细胞内H2O2均大量产生,而且ALA清除ABA诱导产生的保卫细胞H2O2含量的能力被显著减弱,说明PP1/PP2A负调控保卫细胞H2O2的产生;②ALA可抑制外源H2O2诱导的微管解聚和气孔关闭,H2O2清除剂AsA、CAT及NADPH氧化酶抑制剂DPI也可以恢复ABA或外源H202对微管聚合和气孔开放的抑制作用,说明H2O2含量减少会促使微管聚合。以上结果表明,在ALA-ABA调控气孔运动过程中,PP1/PP2A通过下调保卫细胞中H2O2的含量,促进微管聚合,从而导致气孔开放。综上所述,利用苹果叶片和模式植物拟南芥,我们证明了 ALA可以通过促进PP1/PP2A活力而抑制ABA诱导保卫细胞H2O2的产生,进而促进微管聚合,最终抑制ABA诱导的气孔关闭。