肿瘤血管在肿瘤增殖、浸润、转移过程中起重要作用。自1971年Folkman首次提出肿瘤血管新生学说以来，人们普遍接受了肿瘤血管是通过血管新生机制发展而来的概念，认为正常血管内皮细胞向肿瘤组织迁移，在肿瘤组织中形成的新血管分枝。并据此研发了多种药物抗血管新生药物，目前已有5种抗肿瘤血管新生药物用于临床治疗恶性肿瘤，其中Avastin作为重组人抗VEGF单克隆抗体，是第一个经美国FDA批准的抗肿瘤血管新生药物。然而，研究显示现有抗血管新生药物对恶性肿瘤虽有一定的疗效，但难以持久；一旦停药，容易出现肿瘤的复发和转移等。在抗肿瘤血管药物研究中，我们需要广开思路，研发出特异性和高效的抗肿瘤血管新药。近年来研究表明恶性肿瘤血管并非都由血管内皮细胞组成。1999年，Mary JC Hendrix领导的研究小组，揭示了另一种与血管新生完全不同的肿瘤血管形成模式——由肿瘤细胞主导的血管形成，即血管生出拟态，并且受到越来越多人的认可和重视。本研究应用肿瘤细胞体外matrigel上血管生成拟态模型，对本实验室制备的4株单克隆抗体进行抗肿瘤血管研究。结果显示，针对基质金属蛋白酶-2(MMP2）纤维蛋白连接区的单克隆抗体SZ117，能够有效地抑制由肿瘤内皮细胞3B11和人骨肉瘤细胞MG63体外类血管结构的形成。明胶酶谱实验结果表明，SZ117能够有效地抑制肿瘤细胞表达并分泌的MMP2蛋白酶活性，而对MMP9活性没有明显的抑制作用，这说明SZ117可能是通过抑制MMP2活性，进而抑制肿瘤细胞体外血管拟态形成。然而令人惊讶的是，明胶酶谱实验并没有在3B11细胞无血清培养液中检测到MMP2活性，Western Blot实验也同样没有检测到MMP2的表达，这提示SZ117并不是通过抑制MMP2活性来抑制3B11细胞主导的体外血管拟态。据此，我们假设SZ117还可能通过作用于其他分子靶标起肿瘤新生血管抑制作用。接着，我们用WesternBlot、免疫沉淀和质谱分析等一系列方法鉴定SZ117识别MMP2以外的分子靶标。进一步研究发现，SZ117能特异性地识别多种肿瘤细胞中280kDa的高分子蛋白，经免疫沉淀分离和SDS-PAGE纯化以及质谱分析，鉴定出该280kDa的高分子蛋白为Filamin A。交叉反应进一步证实为Filamin A。Filamin A为细胞内蛋白分子的支架,可与多种蛋白相互作用维持细胞稳定性，直接或间接参与肿瘤细胞的增殖、黏附、侵袭、迁徙。Western Blot实验结果显示，FilaminA不但在多种肿瘤细胞中表达，也存在于肿瘤细胞无血清培养液中；SZ117能够检测出280kDa和53kDa蛋白条带，利用标准化Filamin A单克隆抗体证实这两个蛋白条带分别为FilaminA及其降解片段。此外，我们使用相同的方法，在Matrigel （富含细胞外基质）中也检测到FilaminA蛋白及其降解片段。这说明多种肿瘤细胞能够表达并分泌Filamin A及其降解片段，并分泌到细胞外基质中；由此我们推测细胞外基质中的FilaminA也可能促进肿瘤新生血管形成。而SZ117有可能通过特异性地与Filamin A蛋白及其降解片段结合的机制来抑制肿瘤细胞体外血管拟态的形成。另外，在多个白血病病人外周血和骨髓样本中， SZ117能够地识别出280kDaFilamin A蛋白，但在正常人外周血和骨髓样本中却未能检测到该蛋白的表达，提示SZ117有可能特异性地识别肿瘤Filamin A。与Filamin A单克隆抗体几乎能识别所有filamin A相比，SZ117在识别肿瘤细胞中的filamin A更具有特异性。由此推测SZ117识别的filaminA具有一定的肿瘤特异性。通过SZ117识别的MMP2纤维连接蛋白样区域(228-392)与filaminA(1300-1612)的比对，MMP2纤维连接蛋白样区域与filaminA11~14重复序列有39个共同识别的氨基酸，虽然SZ117所识别的抗原表位未鉴定，但这可能是SZ117能够识别filaminA蛋白的基础。基因水平检测此区域，并未检测到异常。考虑到SZ117识别的filamin A蛋白可能在翻译或翻译后修饰中出现问题，进一步明胶酶谱实验发现肿瘤细胞株中有280kDa条带能够降解明胶，由此初步推测SZ117识别的Filamin A蛋白具有一定的异质性,可能促进肿瘤细胞浸润。综上所述，SZ117一方面能够通过抑制MMP2活性，进而抑制部分MMP2阳性肿瘤细胞血管拟态的形成；另一方面，SZ117还能特异性的识别Filamin A，起到肿瘤血管拟态的抑制作用，提示SZ117具有抗肿瘤新生血管的潜能。本研究结果揭示了SZ117抗肿瘤血管生成拟态的作用及其机制，为今后肿瘤新生血管的分子机制研究提供了新的工具的同时，也为新的抗肿瘤药物研发打下了基础。