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第一部分胎牛血清在不同操作温度下对各成熟阶段人类卵母细胞冻融效果的影响目的探索含65%胎牛血清(fetal calf serum ,FCS)的玻璃化优化液在不同的操作温度下对各成熟阶段人类卵母细胞的冻融效果。方法收集我中心行体外受精胚胎移植(in vitro fertilization and embrro transfer ,IVF-ET)患者中受精失败的成熟卵母细胞(metaphase II ,MII)和行卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection ,ICSI)患者中丢弃的未成熟卵母细胞[MI(metaphase I)、GV(germinal vesicle)]。MII卵母细胞用玻璃化方案冻融,玻璃化液为[15%乙二醇(ehtylene glycol ,EG)+15%二甲亚砜(dimethyl sulfoxide ,DMSO)+0.5mol/l蔗糖(sucrose)+65%FCS]。冻融过程中在三种不同的温度下操作分为A组、B组、C组。A组:卵母细胞冷冻时放置在预平衡液的温度为37℃,而放置在玻璃化液(15%EG+15%DMSO)时转在室温(25±2℃),放置在解冻液的操作温度为37℃;B组:卵母细胞放置在冷冻及解冻液的操作温度均为室温;C组:卵母细胞放置在冷冻及解冻液的操作温度均为37℃;未冷冻组为对照组(D组)。GV期卵母细胞采用同MII期卵母细胞一样的冻融程序分别对应为GA、GB、GC和GD组。MI期卵母细胞也采用同MII卵母细胞一样冻融程序分别对应为MA、MB、MC和MD组。未成熟卵母细胞的对照组卵子及解冻后的存活卵子先进行体外成熟( in vitro maturation ,IVM),IVM后的MII卵母细胞、冻融后存活的MII卵母细胞及对照组的MII卵母细胞固定后进行免疫荧光染色,然后用Nikon CISI激光扫描共聚焦显微镜观察纺锤体、染色体形态。结果(1)实验A、B、C组卵母细胞冻融后的存活率分别为95.8%、95.8%和78.3%,各实验组间相互比较无显著性差异(P﹥0.05),实验组A的纺锤体和染色体形态正常率(13%、13%)与对照组的的纺锤体和染色体形态正常率(18.2%、18.2%)比较均无显著性差异(P﹥0.05),实验组A纺锤体的缺失率(IV型)为65.3%,与对照组纺锤体的缺失率(39.4%)相比无显著性差异(P﹥0.05),实验组B纺锤体形态正常率为4.4%,C组的纺锤体和染色体形态正常率均为0%,与对照组比较无显著性差异,实验组B的染色体形态正常率与对照组的染色体形态正常率(0%比18.2%)比较有显著性差异(P﹤0.05),实验组B、C纺锤体的缺失率(IV型)为78.2%、88.9%与对照组纺锤体的缺失率(39.4%)相比存在统计学差异(P﹤0.01和P﹤0.05),纺锤体和染色体各型形态实验组间相互比较C组的III型染色体与A组比较存在显著性差异(P﹤0.05),其余组各型间的相互比较均无显著性差异。(2)实验组GA、GB、GC卵母细胞冻融后的存活率分别为100%、83.3%、66.7%,各实验组间相互比较无显著性差异(P﹥0.05),各实验组的体外成熟率为40%、100%、100%,各实验组间的MII率相互比较及各实验组与对照组60%的MII率相比,无显著性差异(P﹥0.05)。实验组中只有GB组获得了2个纺锤体和染色体形态正常卵母细胞,其余各实验组获得的成熟卵母细胞的纺锤体和染色体形态未有正常者,IVM后获得MII卵母细胞的纺锤体和染色体正常率各实验组间相互比较及各实验组与对照组相比均无显著性差异(P﹥0.05)。(3)实验组MA、MB、MC的MI期卵母细胞冻融后的存活率分别为71.4%、100%、83.3%,各实验组间相互比较无显著性差异(P﹥0.05),MA组IVM后未获得MII卵子,MB、MC和对照组的体外成熟率分别为66.6%、80%、57.1%,各实验组间的MII率相互比较:MA与MB、MC均存在统计学差异(P﹤0.05),而MB与MC间无统计学差异(P﹥0.05),各实验组的MII率(成熟率)与对照组比较无统计学差异(P﹥0.05),各实验组与对照组均未得到纺锤体和染色体形态正常卵母细胞。结论(1)添加65%FCS的改良玻璃化试剂对各成熟阶段卵母细胞的复苏存活率均得到良好的效果。(2) MII期卵母细胞在添加FCS的改良试剂中冷冻时放置在预平衡液的温度为37℃,而放置在玻璃化液(15%EG+15%DMSO)时转在室温,解冻操作温度为37℃的操作条件对纺锤体和染色体的损伤较小。(3)放置在高浓度的玻璃化液时,应选择在室温,使细胞脱水更平缓,能够减少细胞脱水过程因体积剧烈变化带来的损伤。(4) GV期卵母细胞放置在冷冻及解冻液的操作温度均为室温的冻融效果较好,体外成熟获得的MII卵母细胞的纺锤体和染色体正常率最高。(5) MI期卵母细胞放置在冷冻及解冻液的操作温度均为37°C的冻融效果较好,解冻后存活卵母细胞体外成熟培养至MII时间最短,成熟率最高。第二部分两种玻璃化冻融方案对人类成熟期卵母细胞的冻融效果比较目的比较两种玻璃化冻融方案对人类成熟期(MII)卵母细胞纺锤体、染色体的损伤程度。方法收集体外受精胚胎移植中受精失败的MII卵母细胞,分别用两种不同的玻璃化方案冻融,其中方案A:玻璃化保护试剂为(15%EG+15%DMSO+0.5mol/l蔗糖+65%FCS),操作条件:卵母细胞冷冻时放置在预平衡液的温度为37℃,而放置在玻璃化液(15%EG+15%DMSO)时转在室温(25±2℃),放置在解冻液的操作温度为37℃;方案B:玻璃化保护试剂为(15%EG+15%DMSO+0.5mol/l蔗糖),操作条件与A法一致;对照组为未冷冻卵母细胞。解冻后的存活卵母细胞及对照组卵母细胞固定后进行免疫荧光染色,然后用Nikon CISI(激光扫描共聚焦显微镜,confocal)观察纺锤体、染色体形态。结果实验组A、B卵母细胞的存活率分别为95.8%、96.7%,各实验组间相互比较无显著性差异(P >0.05),实验组A卵母细胞的纺锤体、染色体正常率与对照组相比无显著性差异(13%、13%比18.2%、18.2%,P >0.05),实验组B的纺锤体、染色体正常率与对照组比较有显著性差异(0%、0%比18.2%、18.2%,P<0.05)。两实验组的II、III型纺锤体形态与对照组比较无统计学意义(P>0.05),A组纺锤体缺失率(IV型)为65.3%与对照组39.4%比较无显著性差异(P>0.05),B组纺锤体缺失率(IV型)为79.3%与对照组39.4%比较有极显著性差异(P <0.01),III型染色体B组与对照存在极显著性差异(P <0.01)。结论胎牛血清中的胎球蛋白在合适的操作条件下通过改变卵母细胞膜对水的通透性来减少冷冻对纺锤体中微管蛋白的损伤,从而提高冻融卵母细胞的纺锤体和染色体的形态正常率。