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目的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的以关节滑膜慢性炎症性病变为主要表现的自身免疫性疾病,其病理特征主要表现为,滑膜组织异常增生,炎性细胞浸润,新生微血管数量明显增加,血管翳形成,最终侵蚀关节软骨和骨,造成关节破坏。目前认为,滑膜增厚的主要原因是由于成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的过度增生。且研究发现,增生的成纤维样滑膜细胞在功能上处于异常活跃状态,它可以分泌多种促炎性细胞因子、生长因子、趋化因子、基质蛋白酶等,并具有转化特性,对骨与软骨组织造成侵蚀,加速RA关节破坏。因此,阻止成纤维样滑膜细胞的增生和活化,对控制RA的发病和病情进展有重要的意义。TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha)是一种多效性细胞因子,由活化的单核巨噬细胞产生,由于组织特异性的不同,TNF-α对大多数肿瘤细胞表现为促凋亡作用,而对于T淋巴细胞、B细胞、胸腺细胞则表现为促增殖作用。在RA的FLS上,TNF-α表现为促增殖作用,但具体机制尚不完全清楚。TNF-α主要通过和不同细胞表面受体结合发挥其生物学作用,TNF-α有两个受体,分别为TNFRⅠ和TNFRⅡ,属Ⅰ型膜蛋白,为肿瘤坏死因子受体家族,二者的胞外结构域有28%的同源性,但胞内结构域明显不同,TNFRⅠ胞内具有死亡结构域,而TNFRⅡ却不含死亡结构域,TNFRⅠ几乎在所有的细胞上都有表达,但TNFRⅡ只在免疫系统的细胞及内皮细胞上表达,分别独立或共同介导不同的信号传导通路。因为TNF-α是通过其受体发挥作用的。在我们的实验研究中,我们设想通过用一定浓度的TNF-α作用于RA成纤维样滑膜细胞,来观察RA成纤维样滑膜细胞上TNFRⅠ和TNFRⅡ表达比例的变化,进一步探讨TNF-α诱导RA FLS增殖的可能机制。方法1、类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的原代培养:在无菌条件下取得新鲜的RA滑膜组织,胶原酶消化法分离纯化滑膜成纤维细胞,实验用3-7代细胞。2、TNF-α作用RA FLS后,HE染色,观察FLS形态学的变化。3、MTT实验观察不同浓度的TNF-α对RAFLS增殖的影响。4、RT-PCR实验观察一定浓度的TNF-α作用于RA FLS后,FLS上TNFRⅠ和TNFRⅡ的mRNA表达比例的变化。结果1、RA FLS的形态学观察:20ng/ml的TNF-α持续作用RA FLS48h后,HE染色,与对照组(0ng/ml)相比,在相差显微镜下观察细胞形态。可见给予20ng/mlTNF-α的FLS细胞密度增加,但细胞形态未见明显改变,细胞呈束状排列,相差显微镜下见细胞形态以梭形为主,两极胞突细长,苏木素-伊红染色高倍镜下多数细胞核巨大呈圆形或椭圆形,核仁明显,核仁数目1-3个不等。2、不同浓度的TNF-α对RAFLS增殖的影响:不同浓度的TNF-α对RAFLS作用72小时后,MTT实验结果显示,TNF-α1ng/ml浓度组FLS的增殖率与对照组(0ng/ml)相比差异不显著,余各浓度组所对应的FLS增殖率与对照组相比均差异显著(P<0.01),且TNF-α在10ng/ml时,增殖作用达高峰,这种促增殖效应在一定范围内有剂量依赖性。3、RT-PCR半定量分析结果显示:当未给予TNF-α刺激时,RA FLS的TNFRⅠmRNA的表达水平明显高于TNFRⅡmRNA,TNFRⅠ/TNFRⅡ的比值为2.449。在给予TNF-α(10ng/ml)诱导下,6 hTNFRⅠ/TNFRⅡ的比值为1.461,12hTNFRⅠ/TNFRⅡ的比值为0.951,24hTNFRⅠ/TNFRⅡ的比值为0.512,降至最低,48hTNFRⅠ/TNFRⅡ的比值为0.648,可见随着时间改变,TNFRⅠ和TNFRⅡ的mRNA表达比例发生改变,TNFRⅠ表达下调,TNFRⅡ表达上调,在24h达高峰,表现出时间依赖效应。结论1、TNF-α在体外具有抑制RAFLS凋亡,促进FLS增殖作用。2、TNF-α在体外可能通过上调TNFRⅡ表达,下调TNFRⅠ表达,使RA FLS凋亡减低,促进了RA滑膜组织的增殖。