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基因打靶技术包括基因敲入(Gene knock-in)与基因敲除(Gene knock-out),是通过同源重组将外源基因定点整合入ES细胞基因组上某一确定的位点,以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。构建打靶载体是该技术运用中的一个关键环节。Cre-loxP系统的条件基因敲除技术,是在细胞或组织特异性的Cre重组酶knock-in或转基因小鼠的作用下,实现在特定细胞及特定发育阶段敲除目的基因并研究其功能的一项重要的实验手段。采用Cre-loxP重组系统实现组织特异性基因敲除可以克服传统的完全基因敲除技术的这一缺陷,能有效地避免完全敲除导致的胚胎致死。在这个系统中,细胞或组织特异性的Cre重组酶knock-in或转基因小鼠的研制是至关重要的一环。到目前为止,已有多种在不同免疫细胞中特异性表达的Cre重组酶knock-in或转基因小鼠,如:B细胞;T细胞;树突细胞;巨噬细胞;嗜中性粒细胞等均有特异性表达的Cre重组酶knock-in或转基因小鼠。但在NK、NKT细胞特异性表达的Cre重组酶knock-in或转基因小鼠尚未见报道。制备细胞或组织特异性的Cre重组酶knock-in或转基因小鼠,最常用的方法是用细胞或组织特异性表达基因的启动子来调控Cre重组酶的表达。NK1.1是目前已知的在小鼠的NK、NKT细胞特异性的标志分子,是NK细胞NKR-P1家族中的一个成员NKR-P1C,在小鼠CD分组中编号为CD161。此外,129/Ola和C57BL/6J品系小鼠都表达NK1.1分子,只是129/Ola品系小鼠表达的NK1.1分子与C57BL/6J品系小鼠表达的NK1.1分子相比,有一个氨基酸突变(191位的丙氨酸Ala变成了苏氨酸Thr)而不能被NK1.1分子的抗体识别。因此NK1.1启动子十分适合作为本研究的组织特异性启动子以介导Cre重组酶在NK、NKT细胞中的表达。本文利用Recombineering技术成功构建了将Cre基因定点敲入到小鼠NK1.1基因启动子下的Cre knock-in基因打靶载体。后续用此载体转染小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES cells),然后通过PCR的方法鉴定出打靶正确的ES细胞,再将其显微注射到C57BL/6J品系与DBA2品系的F2代子代的囊胚(Blastocyst)(E3.5天),并将10-20个囊胚植入假孕雌鼠子宫,获得嵌合体小鼠。将得到的嵌合率较高的雄性嵌合体小鼠与C57BL/6J雌性小鼠交配,观察F1代小鼠的毛色。通过PCR鉴定F1代棕色小鼠基因型,进而确定构建的NK1.1-Cre knock-in小鼠模型。本文首次构建了NK、NKT细胞特异性表达Cre重组酶knock-in小鼠,该小鼠的成功建立,可广泛应用于在NK、NKT细胞中进行组织特异性基因打靶研究,为利用条件基因打靶技术深入研究特定基因在NK、NKT细胞发育过程中,以及在相关疾病中的作用和机制奠定了坚实的基础。因此预测,未来几年将会有更多的在不同免疫细胞中特异性表达的Cre重组酶knock-in或转基因小鼠会被构建出来,用以在不同免疫细胞中对某些基因的功能进行特异性的研究。