奶牛低钙血症是围产期奶牛高发的一种以钙稳态失衡为主的营养代谢病,极易导致子宫内膜炎及乳房炎等炎性疾病的发生,给奶牛业带来了巨大的经济损失。钙离子作为细胞内的一种重要第二信使参与细胞增殖、分化、激素分泌、糖原代谢以及免疫细胞免疫功能的调节。ORAI1作为钙池引发的钙离子进入（SOCE）通路的膜蛋白,是免疫细胞内控制钙离子进出的主要通路。中性粒细胞（PMN）作为机体第一道防线在感染初期的防御中起着重要作用,其杀灭病原体的方式主要包括迁移、黏附、趋化、吞噬、脱颗粒作用等。然而低钙血症奶牛中性粒细胞的免疫功能调控机制尚不清晰。因此本实验拟通过分析低钙血症奶牛血液中性粒细胞SOCE通路相关因子水平,以阐释奶牛低钙血症对中性粒细胞免疫功能的影响,为全面评价低钙血症奶牛免疫机能特征提供科学的理论依据。本实验拟通过采集产后3天低钙血症和健康奶牛血液,根据检测的血浆钙浓度和奶牛临床体征分组。低钙血症组血浆中Ca²⁺浓度为1.4-2.00 mmol/L,无明显的低钙血症临床症状;对照组血浆中Ca²⁺浓度为2.10-2.8 mmol/L,分离PMN。为了探究奶牛低钙血症状态下对PMN免疫功能的调控机制,我们应用ELISA检测PMN趋化功能,流式细胞术检测PMN迁移、吞噬能力以及活性氧水平,应用激光共聚焦检测检测PMN黏附能力和产生的胞外诱捕网的状态,应用透射电镜检测PMN线粒体形态。结果显示,在奶牛低钙血症状态下PMN迁移、黏附、吞噬能力、活性氧水平以及胞外诱捕网等功能均显著降低。这一结果说明奶牛低钙血症状态下能够降低外周血PMN免疫功能。为了探究奶牛低钙血症状态下ORAI1调控外周血PMN免疫功能的机制,我们应用流式细胞术检测细胞内钙离子,应用普通PCR检测基因水平上ORAI1的表达,免疫荧光检测蛋白水平上ORAI1的表达。体外添加钙离子载体离子霉素（ionomycin）、肌内膜Ca²⁺ATPase抑制剂毒胡萝卜素（TG）、ORAI1抑制剂2-APB、转染siORAI1沉默试剂,利用流式细胞术、激光共聚焦等分子生物学技术检测细胞膜表面ORAI1丰度、ROS水平、吞噬、迁移能力。结果表明Orai1在健康和低钙血症组PMN中均有表达,且在低钙血症奶牛中ORAI1蛋白丰度显著低于健康组。添加ionomycin和TG后健康对照组与低钙血症组ORAI1蛋白丰度均显著增加,而添加2-APB显著降低健康对照组和低钙血症组ORAI1蛋白丰度。低钙血症奶牛PMN迁移、吞噬、黏附能力和ROS水平均显著低于健康奶牛,经ionomycin和TG体外刺激后,PMN迁移、吞噬、黏附能力和ROS水平均显著升高;经2-APB刺激后均降低。NETs结果显示,低钙血症奶牛中性粒细胞释放到胞外的DNA相比健康的奶牛要少,说明消除病原能力吞噬更弱。沉默ORAI1后PMN的ROS、趋化、迁移、黏附、吞噬等生物学功能都显著降低。以上实验结果表明,我们能够确定奶牛低钙血症通过ORAI1调控外周血PMN免疫功能。为了探究血浆钙与细胞内钙的关系,本实验利用ELISA试剂盒检测健康和低钙血症奶牛血浆中的甲状旁腺素和1,25（OH）₂D₃;体外添加PTH和骨化三醇刺激PMN,经流式细胞术检测ORAI1丰度以及细胞内钙离子浓度。结果显示康奶牛的1,25（OH）₂D₃显著高于低钙血症奶牛,PTH没有差异。骨化三醇和PTH显著增加健康组和低钙血症PMN的ORAI1丰度和细胞内钙离子浓度。以上实验结果表明,血浆钙通过PTH或1,25（OH）₂D₃影响对ORAI1以及细胞内钙离子的调节,从而参与PMN活化的调节。综上所述,奶牛低钙血症通过调控ORAI1显著的降低PMN的免疫功能,且血钙通过PTH和1,25（OH）₂D₃对细胞内钙起到调控作用。