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干旱胁迫是农业生产中存在的重要问题,对世界作物产量的影响,在环境胁迫中占首位。而国内外关于干旱对果树的影响及其适应机理研究落后于其它农作物。苹果是世界上重要的栽培果树之一,是我国北方落叶果树中栽培面积最大的树种之一。苹果是嫁接繁殖的果树,其抗逆性主要决定于砧木。在我国苹果砧木的抗性研究起步较晚,因此了解苹果砧木的耐旱能力,深入研究干旱胁迫对苹果砧木的伤害及其响应生理和分子机理,对抗旱遗传改良都具有重要的意义。本文以两年生楸子（Malus prunifolia（Willd）Borkh.）和平邑甜茶（M. hupehensis （Pamp） Rehd.）盆栽幼苗为试材,采用控水方式进行干旱处理。比较分析了干旱胁迫下这两种苹果砧木叶片的活性氧代谢变化、细胞形态解剖结构及亚细胞超微结构的变化及其两者的抗性差异。在此研究基础上利用抑制消减杂交（SSH）技术构建干旱处理的楸子叶片cDNA文库,筛选并鉴定出部分与抗旱相关的ESTs,并应用定量PCR（qRT-PCR）技术分析它们在干旱胁迫下的表达谱。采用菌液PCR筛选SSH cDNA文库与电子克隆方法,克隆抗性基因的全长cDNA序列,运用生物信息学方法分析抗性基因的核酸序列特征、基因编码的氨基酸序列特征及分子进化关系,使用同源建模技术预测和分析基因编码蛋白的空间结构与生物功能。另外,采用qRT-PCR和半定量PCR技术分析抗性基因在不同组织及不同逆境胁迫下的表达谱。主要结果如下:1.楸子和平邑甜茶对干旱胁迫的生理响应不同。耐旱性强的楸子受到氧化胁迫的伤害较小,其抗氧化防御能力强于耐旱性较差的平邑甜茶。正常水分条件下,楸子和平邑甜茶幼苗叶片内活性氧代谢系统均无明显变化。在干旱处理后,两种苹果砧木叶片中O2产生速率和H2O2含量均增加,膜脂过氧化产物MDA含量上升,且随着干旱胁迫程度的加重呈上升趋势。抗氧化酶SOD、CAT和POD活性及AsA-GSH循环系统中的4种关键酶,即APX、GR、MDHAR和DHAR活性,在干旱胁迫前期和中期都有所提高,而在后期降低,部分抗氧化酶活性低于对照。干旱胁迫下,抗氧化剂AsA和GSH含量呈现先升后降的变化趋势,在干旱胁迫结束时（12 d）均低于对照（楸子GSH除外）。与平邑甜茶相比,楸子具有较低的ROS水平和较高的抗氧化系统的防御能力。这些结果表明,干旱胁迫下两种苹果砧木幼苗叶片中活性氧（reactive oxygen species,ROS）增加,诱导植株体内抗氧化防御系统启动以减轻（缓）或抵抗干旱胁迫对细胞所造成的氧化伤害;但随着干旱胁迫程度的持续加重,植株抗氧化防御能力下降,ROS大量积累,导致细胞膜脂过氧化加重,MDA大量产生。而楸子植株叶片的活性氧清除系统能力高于平邑甜茶。2.干旱胁迫下,两种苹果砧木叶肉细胞的形态解剖结构及亚细胞超微结构发生了适应性变化,但两者之间存在较大的差异。光学显微镜观察发现,干旱胁迫下苹果砧木的叶片厚度、栅栏组织厚度及叶肉组织结构紧密度（CTR）都减小,海绵组织厚度、角质层厚度及叶肉组织结构疏松度（SR）均增加。与平邑甜茶相比,干旱胁迫下楸子叶肉细胞形态解剖结构的变幅较小。电子显微镜观察发现,干旱胁迫下,两种苹果砧木叶片的亚细胞超微结构发生了明显的变化,细胞损伤程度随着干旱胁迫程度的加重而增加。其主要的变化有:细胞体积变小、细胞核浓缩、细胞质凝集、细胞器数目减少、细胞膜结构解体、叶绿体膨胀及空泡化、基质片层（stroma lamella）排列混乱、淀粉粒消失、线粒体肿胀及嵴变模糊、表皮细胞气孔密度增大、气孔开张度变小等。与平邑甜茶相比,干旱胁迫下楸子叶片亚细胞超微结构遭受的损伤程度较小,楸子能较好地维持其细胞结构的完整性。3.以干旱处理的楸子幼叶为tester,正常生长的楸子幼叶为driver,利用SSH技术构建了一个干旱胁迫下楸子叶片的消减cDNA文库。该文库的重组率高于95%,插入片段集中在250600 bp之间。经蓝白斑抗性筛选和菌液PCR鉴定后,对所挑选的阳性克隆进行测序而获得大量的ESTs。BLASTN和BLASTP比对分析表明,大部分ESTs与己知逆境胁迫相关基因在核酸和蛋白水平上有较高的同源性,也有一些ESTs功能未知。通过GO（gene ontology）分类进行功能注释,ESTs编码产物涉及能量、光合、蛋白质水解、RNA转录、信号转导、逆境防御以及功能未知和没有匹配的序列等。对文库部分克隆进行测序发现,文库中含有半胱氨酸蛋白酶、金属硫蛋白、凋亡因子、富含甘氨酸RNA结合蛋白、叶绿素a/b结合蛋白、光系统2放氧复合物增强蛋白等大量的抗旱相关基因。采用qRT-PCR对部分抗旱相关基因在楸子叶片和根系的表达谱进行分析。结果表明,干旱胁迫下大多数的所检测基因都上调表达,也有个别基因下调表达,但它们的表达强度和时序有所不同。由此可见,干旱胁迫下楸子植株体内与干旱相关的基因被诱导表达,这些基因可能参与楸子对干旱胁迫的抗性反应。4.通过菌液PCR筛选SSH cDNA文库和电子克隆,从楸子和平邑甜茶叶片中分别克隆到1个富含甘氨酸RNA结合蛋白（glycine-rich RNA-binding protein,GR-RBP）基因,并分别命名为MpGR-RBP1（HM042682）和MhGR-RBP1（HQ380209）。楸子MpGR-RBP1和平邑甜茶MhGR-RBP1基因分别编码171和164个氨基酸多肽,它们都包含一个RNA识别结构域（RNA recognition motif,RRM）和一个富含甘氨酸区（glycine-rich region）。Genbank数据库检索结果表明,该同源基因在苹果属（Malus）中为首次分离。经SignalIP 3.0和PSORT预测,这2个同源基因所编码的产物可能为非跨膜蛋白,位于细胞核中,能与RNA结合,属于转录因子类蛋白。序列比对及分子进化关系分析表明,MpGR-RBP1与MhGR-RBP1、欧洲甜樱桃（93.0%,AAL13082）、大豆（86.0%,AAD48471）、天竺葵（84.9%,AAB63581）、烟草（84.3%,ACD03270）马铃薯（82.9%,ABB87126）、柑橘（82.6%,BAA92156）、拟南芥（80.2%,AAM62447）、苜蓿（80.7%,AAF06329）等蛋白的同源性较高。表达谱分析表明,在转录水平上,MpGR-RBP1与MhGR-RBP1基因具有组织特异性;均受干旱诱导上调表达。MhGR-RBP1基因受盐胁迫诱导上调表达;在外源激素ABA或JA处理下,其表达被抑制,推测MhGR-RBP1基因表达可能属于非依赖ABA或非依赖JA的调控途径。在干旱胁迫下,MpGR-RBP1与MhGR-RBP1转录产物迅速积累,参与干旱逆境胁迫的响应反应,而它们是否在转录后或翻译水平调控苹果砧木抗性反应还需要进一步研究。