目的:用KA、三气培养、燃蜡烛法建立NSCs损伤模型，比较三气培养和燃蜡烛法缺氧损伤模型，研究TGF-β<,1>对NSCs缺氧损伤是否具有保护作用。 方法: 1.从新生一天大鼠大脑皮质分离、培养、增殖、传代、诱导分化、鉴定神经干细胞(Neural stem eells，NSCs)，在无血清培养基条件下增殖，进行Nestin鉴定，在多聚赖氨酸促使贴壁后，加入血清诱导分化，使用β-ⅢTubulin和GFAP分别鉴定神经元和星型胶质细胞。 2.用三气培养箱制备NSCs缺氧损伤模型取传代细胞，随机分为2组：①正常对照组：普通培养6小时；②三气缺氧组：三气培养箱培养6小时(N<,2> 94％、CO<,2>5％、O<,2> 1％)。各组在相应时间点均用Hoechst33258进行荧光染色，镜下观察、计算Hoechst阳性细胞率，以评估NSCs在三气缺氧法制备的缺氧模型中的损伤情况。 3.用燃蜡烛法制备NSCs缺氧损伤模型取传代细胞，随机分为3组：①正常对照组：普通培养6小时；②燃蜡烛对照组：在37℃恒温箱内点燃蜡烛后密封容器，待其熄灭后打开盖子再盖上密封，然后孵育6小时；③燃蜡烛缺氧组：在37℃恒温箱内点燃蜡烛后密封容器，待其熄灭后孵育6小时。各组在相应时间点均用Hoechst33258进行荧光染色，镜下观察、计算Hoechst阳性细胞率，以评估NSCs在燃蜡烛法制备的缺氧模型中的损伤情况。 4.比较燃蜡烛法和三气培养箱法缺氧损伤模型取传代细胞，随机分为4组：①正常对照组：普通培养6小时；②燃蜡烛对照组：在37℃恒温箱内点燃蜡烛后密封容器，待其熄灭后打开盖子再密封，然后孵育6小时；③燃蜡烛缺氧组：在37℃恒温箱内点燃蜡烛后密封容器，待其熄灭后孵育6小时；④三气缺氧组：三气培养箱培养6小时(N<,2> 94％、CO<,2> 5％、O<,2> 1％)。各组在相应时间点均用Hoechst33258进行荧光染色，镜下观察、计算Hoechst阳性细胞率。 5.建立NSCs的KA损伤模型 取传代细胞，随机分为7组：①正常对照组；②100uM组；③500uM组；④1mM组；⑤2mM组；⑥3mM组；⑦4mM组。正常组普通培养4个小时，其它各组加入KA后普通培养4小时。各组在相应时间点均用Hoechst33258进行荧光染色，镜下观察、计算Hoechst阳性细胞率，以比较不同浓度KA的对NSCs损伤的影响。 6.TGF-β<,l>对NSCs缺氧损伤的保护作用 取传代细胞，随机分为4组：①正常对照组：普通培养6小时；②TGF-β<,l>组：加/KTGF-β<,l>后普通培养7小时；③缺氧组：普通培养l小时后缺氧培养6小时(N<，2>94％、CO<,2>5％、O<,2>1％)；④TGF-β<,l>+缺氧组：加入TGF-β<,l>后普通培养1小时，再缺氧培养6小时。各组在相应时间点均用Hoechst33258进行荧光染色，镜下观察、计算Hoechst阳性细胞率。 结果采用SPSSl3.0统计软件分析，数据以均数±标准差表示(mean±SD)。凋亡率数据先用arcsin平方根P转换后进行方差齐性检验，然后行单因素方差分析。以P＜0.05表示在统计学上有显著性差异，P＜0.01表示在统计学上有极显著差异。 结果: 1.在未诱导分化前，传代培养细胞呈Nestin免疫反应阳性，用FBS诱导分化后则分别呈β-ⅢTubulin、GFAP免疫反应阳性，表明分离到的是神经干细胞。 2.Hoechst33258染色时，凋亡细胞呈强亮蓝色荧光，为阳性；正常细胞弥漫均匀着色，无强荧光，为阴性。正常对照组偶见Hoechst33258强荧光着色的凋亡细胞，而三气缺氧组的凋亡细胞明显增多(P＜0.01)。 3.燃蜡烛缺氧组Hoechst染色阳性细胞比正常对照组和燃蜡烛对照组明显增多(P＜0.01)；正常对照组和燃蜡烛对照组相比，差别无显著性(P＞0.05)。 4.燃蜡烛缺氧组的Hoechst染色阳性细胞比三气缺氧组稍多，但无统计学意义(P＞0.05)。 5．正常组、100uM KA组、500uM KA组、1mM KA组的Hoechst染色阳性细胞少见，后3组与正常组相比差别无显著性(P>0.05)。2mM KA组、3mM KA组、4mM KA组的Hoechst染色阳性细胞明显增多(P<0.01)，而且3mM KA、4mMKA组Hoechst染色阳性细胞比2mM KA组多(P<0.01)。 6．正常对照组和TGF-β<,1>组的Hoechst染色阳性细胞少见。缺氧组Hoechst染色阳性细胞明显增多(P<0.01)，TGF-β<,1>+缺氧组的Hoechst染色阳性细胞比缺氧组少(P<0.01)，但仍比正常对照组多(P<0.01)。 结论: 1．建立了NSCs的三气和燃蜡烛缺氧损伤模型，与三气缺养相比，燃蜡烛法所造成的NSCs缺氧损伤略重。 2．建立了NSCs的KA损伤模型，100uM、500uM、1mM的KA不能损伤NSCs，2mM时NSCs出现损伤，4mM时出现明显损伤。 3．TGF-β<,1>可以减少缺氧诱导的NSCs的凋亡，提示TGF-β<,1>对NSCs缺氧损伤有保护作用。