第一部分围产期过量铅暴露小鼠的模型构建及成年后睡眠结构分析【目的】建立小鼠过量铅暴露的动物模型并验证过量铅暴露动物模型,观察小鼠从胚胎形成前2周至分娩后1月龄期间暴露在不同浓度的铅环境下对于小鼠远期睡眠结构的影响,分析小鼠睡眠总时间、入睡潜伏期、睡眠维持能力、日间觉醒情况,以及睡眠转换能力的变化,确定小鼠围产期的铅暴露是否导致小鼠成年后出现睡眠障碍,并通过睡眠脑电图分析围产期过量铅暴露小鼠成年后出现睡眠障碍的类型与程度。【方法】1.将6只成年雌性J:DO小鼠用随机数表法随机分成三组,分别为0ppm组,30 ppm组,300 ppm组。雌性小鼠在交配2周前开始给予各组相应浓度的含铅溶液,随后在其笼中分别投入1只正常饮水及进食的成年雄性J:DO小鼠进行交配,直至雌性小鼠怀孕后将雄性小鼠分笼。雌性小鼠在怀孕期间持续给予各分组对应浓度铅溶液,并一直持续到其娩出幼崽,此后母鼠继续饮用含铅溶液并对幼崽进行哺乳,直至4周后小鼠可独立进食时将小鼠与母鼠分笼饲养。此后对幼年小鼠予以常规饮水及食物。2.随机在0 ppm,30 ppm,300 ppm这3组不同浓度围产期铅暴露幼鼠中各抽取5只小鼠取血样并检测其在幼年期血铅水平。3.在小鼠进入成年期(6月龄)时对3组小鼠进行头颅及颈部肌肉电极植入手术,调试睡眠记录装置后进行24小时的连续睡眠脑电、肌电信号收集。4.睡眠记录的结果采用Windows版Sleep Sign for Animal软件3.0版本的算法自动分析后进行人工逐帧修正,对计算出的结果进行汇总后再进行后续的统计学分析。【结果】1.小鼠体内铅残余:(1)围产期过量铅暴露小鼠1月龄时血液铅浓度组间对比:与0ppm对照组相比(6.0±7.6ppm),30ppm组血液铅浓度明显升高(125.8±13.9ppm,p<0.0001),300 ppm血液铅浓度显著增高(418.9±35.2ppm,p<0.0001);(2)铅暴露小鼠成年后(6月龄)体内血液系统铅残余与幼年对比:与1月龄0ppm组小鼠相比(6.0±7.6ppm),成年0ppm组铅浓度无明显变化(<0.01ppm,p=0.9887);与1月龄30ppm组相比(125.8±13.9ppm),成年30 ppm组血液铅浓度明显减低(<0.01ppm,p<0.0001);与1月龄300ppm组相比(418.9±35.2ppm),成年300 ppm组血液铅浓度显著降低(0.0376±0.01ppm,p<0.0001);(3)成年后(6月龄)小鼠体内血液系统残余铅浓度的组间对比:与0ppm组(<0.01ppm)相比,300ppm组铅浓度显著增高(0.0376±0.01ppm,p<0.001);(4)成年后(6月龄)小鼠体内肝脏铅残余组间对比:与0ppm组相比(0.1ppm),300ppm组肝脏铅浓度显著增高(0.8446±0.48ppm,p<0.0001);(5)成年后(6月龄)小鼠体内长骨中铅残余组间对比:与0ppm组(0.1ppm)相比(0.1ppm),300ppm组长骨中铅浓度显著增高(57.4±25.4ppm,p<0.001);2.过量铅暴露小鼠成年后睡眠结构改变:(1)觉醒能力变化:与对照组0ppm相比(44.5±13.7min),30ppm组在开灯后时间点ZT2-4觉醒比例下降(65.2±13.5 min,p<0.05);与对照组比(53.7±17.3 min),300 ppm组在ZT8-10觉醒比例下降(75.0±16.3 min,p<0.05);与对照组相比(79.0±12.4 min),300 ppm在ZT12-14觉醒比例下降(101.0±10.5 min,p<0.05);(2)NREM睡眠维持能力变化:与对照组相比ZT8-10(58.7±13.1 min),ZT12-14(38.1±11.5 min),300 ppm组在开灯后NREM睡眠量降低ZT8-10(39.8±15.7 min,p<0.05),ZT12-14(16.6±8.9min,P<0.05)。(3)关灯后REM睡眠量改变:与对照组相比(25.9±8.7min),300 ppm组REM睡眠量明显增加(37.4±6.9min,P<0.05)。(4)睡眠状态转换能力改变:与对照组相比(273.8±44.8次),300 ppm组由NREM睡眠转换为觉醒的次数显著减少(204.3±70.2,P<0.01);与对照组相比(290.5±42.7次),300 ppm组由觉醒转换为NREM睡眠的次数也出现明显减少(239.6±73.9,P<0.05)。(5)短时间觉醒(<16s)总时长在开灯与关灯时间后变化:开灯后与对照组相比(210.7±66.8次),300 ppm在<16s时的觉醒片段明显减少(103.1±56次,P<0.0001);关灯后与对照组相比(149±21.3次),300 ppm在<16s时长的觉醒片段减少(103.1±56次,P<0.0001)。【结论】1.围产期过量铅暴露小鼠在幼年期的血液铅浓度远高于成年鼠;与对照组相比,围产期暴露在300ppm浓度铅环境中的小鼠成年后依然在体内血液、肝脏、骨骼等多器官中存在更多的铅残余,且骨骼中蓄积的铅含量明显高于血液和肝脏。2.与对照组相比,铅暴露组小鼠在开灯觉醒时间明显增多,关灯REM睡眠明显增多,表明围产期过量铅暴露可以导致小鼠在成年后开灯期的觉醒比例增加。3.围产期过量铅暴露小鼠的开灯期间睡眠总量未见明显差别,但睡眠状态转换能力(NREM睡眠和觉醒转换之间)存在障碍。4.与对照组相比,围产期过量铅暴露小鼠成年后在全天(含开灯期和关灯期)短时觉醒片段(<16s)的总数量下降,表明与对照组相比,围产期过量铅暴露小鼠睡眠及清醒状态下的警觉性下降,对外界刺激的反应性降低。第二部分围产期过量铅暴露对小鼠睡眠/觉醒神经元的影响【目的】确定不同浓度围产期过量铅暴露小鼠在6月龄成年时,其大脑中各脑区是否存在铅富集并测量其相对浓度,结合相应脑区的功能及其与正常睡眠、觉醒功能的关联程度,确定本实验的目标研究脑区,并对其相应核团中睡眠/觉醒神经元细胞进行三维空间计数、形态学观察及定量检测,确定围产期铅暴露小鼠相应控制睡眠脑区中睡眠/觉醒神经元的损伤、凋亡情况。【方法】1.延续第一部分,从胚胎形成前1月至出生后1月龄予以母鼠0ppm,30ppm,300ppm无机铅饮水,得到相应的围产期过量铅暴露JD:O小鼠模型,此后给予幼鼠正常饮水、进食饲养至6月龄,在3组中随机抽取1只小鼠,对主要脑断层切片中使用激光烧蚀光谱成像法对脑组织中铅沉积水平进行检测,确定铅的主要富集区域及相对浓度,并比较三组间各区域浓度差别。2.根据铅富集区域与已知睡眠调控区域的关联,锁定相关脑区进一步对其进行研究。3.在3组小鼠中随机选取5只小鼠,使用免疫组织化学法比较对相应脑片中Orexin的表达情况,并比较围产期铅暴露小鼠神经元的形态学变化。观察完成后进行Gimsa染色,光镜下使用Stereo Investigator软件对各组过量铅暴露小鼠外侧下丘脑区域的Orexin神经元的总数进行评估,确定过量铅暴露对小鼠下丘脑外侧区(Lateral-Hypothalamus,LH)Orexin神经元数量的影响。4.另随抽取5只小鼠,使用RT-PCR检测LH区域Orexin表达水平变化,进一步在RNA层面验证Orexin的表达情况。【结果】1.与对照组相比(3944.8±249.4),围产期过量铅暴露小鼠成年后其下丘脑外侧区域的orexin神经元数量在30 ppm组明显下降(3515.4±134.4,P<0.05),300 ppm组显著下降(2735.0±153.9,P<0.01)。2.光镜下显示围产期过量铅暴露组与对照组相比,LH区域的Orexin神经元密度下降,形态异常。3.RT-PCR显示在LH区,与对照组相比(2.3±1.0),30 ppm组Orexin m RNA表达水平呈现明显降低(0.5±0.3,P<0.001),300 ppm组显著降低(0.5±0.4,P<0.001)。【结论】1.围产期的过量铅暴露可以导致小鼠在成年后(6月龄)脑中依然存在超量铅富集,铅主要沉积在小鼠的皮质,下丘脑外侧区,海马等区域。2.围产期过量铅暴露导致小鼠成年后LH区域的Orexin阳性的神经元数量显著下降,Orexin神经元密度下降,表明围产期铅暴露导致小鼠成年后的Orexin神经元依然存在严重损害,而其受损可能是导致围产期铅暴露小鼠成年后睡眠结构紊乱的原因。第三部分围产期过量铅暴露小鼠睡眠/觉醒神经元损伤的机制【目的】检测各组小鼠下丘脑外侧区中Tau蛋白的含量、异常磷酸化Tau蛋白含量、观测Tau蛋白清除功能,探讨围产期过量铅暴露导致小鼠睡眠/觉醒神经元损伤的机制及其与Tau蛋白异常沉积的关系。【方法】1.围产期过量铅暴露小鼠分为0ppm,30ppm,300ppm共3组,在每组中随机抽取5只小鼠,对其麻醉处死后,采用免疫荧光法观察下丘脑外侧区磷酸化Tau(AT8)和Orexin的表达,并使用image j软件对荧光强度进行分析,从而确定Orexin神经元中的是否存在Tau蛋白沉积及其严重程度。2.使用免疫荧光法检测小胶质细胞(IBA-1)和Orexin两者共表达的情况,明确围产期过量铅暴露小鼠成年后Orexin神经元周围小胶质细胞的数量变化。3.应用蛋白质免疫印迹技术(Western-blot)测定下丘脑区域的磷酸化Tau蛋白(Ser-202)和微管相关Tau蛋白(Microtubule-associated protein tau,MAPT)的表达。【结果】1.免疫荧光半定量分析结果:与对照组相比(0.07±0.02),30ppm过量铅暴露组下丘脑外侧区Orexin神经元中磷酸化Tau(AT8)表达明显增高(0.78±0.30,p<0.05),300ppm铅暴露组磷酸化Tau(AT8)表达显著增高(2.23±0.54,p<0.0001)。2.与对照组(0.621±0.030/pixel)相比,300ppm铅暴露组LH区域(0.203±0.016/pixel,p<0.001)的小胶质细胞数量显著减少。3.W-B结果:与对照组(7.21±1.03)相比,300ppm过量铅暴露组(6.92±1.53,P>0.05)下丘脑外侧区Tau(MAPT)蛋白与对照组相比无显著性区别;与对照组(0.79±0.18)相比,300ppm铅暴露组(1.70±0.43,p<0.01)的磷酸化Tau(Ser-202)蛋白的量与对照组相比显著增高。【结论】过量铅暴露导致过量Tau蛋白过量聚集于Orexin神经元中,同时伴有LH区域小胶质细胞数量下降,表明围产期铅暴露可以造成小鼠成年后Orexin神经元中有生物学活性的磷酸化Tau蛋白异常沉积,对神经元毒性物质的清除能力减弱,这可能是导致过量铅暴露小鼠Orexin能神经元损伤的机制。