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目的：猪苓是药用真菌,具有增强免疫、抗肿瘤功能等作用,临床应用于膀胱癌的治疗取得了较好疗效,但其作用机制尚未完全阐明。猪苓的主要化学成分是多糖和甾体类,另外还有蛋白质、生物素等。本实验主要研究猪苓活性成分通过调节HuR介导膀胱癌T24细胞增殖抑制和凋亡的机制。通过实验达到如下目的：1、研究HuR能否调控T24细胞BCL-2 mRNA转录后表达。2、研究猪苓多糖能否通过HuR介导的转录后调节途径调控T24细胞BCL-2基因的表达。3、研究麦角甾醇能否通过HuR介导的转录后调节途径调控T24细胞cyclin D1基因的表达。方法：1、研究HuR过表达对T24细胞BCL-2 mRNA转录后表达的调节T24细胞用无抗生素的培养基培养24小时后进行转染实验,实验设空白对照组(未做任何处理)、阴性对照组(用阴性对照质粒转染)、HuR质粒转染组(用HuR质粒转染)。用Western blotting检测各组HuR的表达,检验过表达的效果。构建HuR过表模型,于过表达HuR后相应时间点用放线菌素D(Actinomycin D)终止RNA的合成,并于处理后的0h、2h、4h、6h四个时间点分别收集细胞提取RNA,以RT-PCR的方法检测BCL-2 mRNA的半衰期,研究HuR过表达对T24细胞BCL-2 mRNA稳定性的影响。构建HuR过表达模型,于过表达HuR后24h用RT-PCR测定BCL-2 mRNA表达,用Western blotting检测BCL-2蛋白的表达,分析HuR过表达后BCL-2 mRNA和蛋白表达量的变化。2、研究HuR沉默对T24细胞BCL-2 mRNA转录后表达的调节T24细胞用无抗生素的培养基培养24小时后进行转染实验,用siHuR转染T24细胞,实验设空白对照组(未做任何处理)、阴性对照组(加入阴性对照siRNA)、 siHuR处理组(加入针对HuR编码区的siRNA)。转染24h后,用Actinomycin D终止RNA的合成,后按预定时间点检测BCL-2 mRNA的含量,并计算其半衰期,研究HuR沉默对T24细胞BCL-2 mRNA稳定性的影响。构建构建HuR基因沉默模型,用RT-PCR测定HuR基因沉默对T24细胞BCL-2mRNA表达的影响,用Western blotting检测HuR基因沉默对T24细胞BCL-2蛋白的表达的影响。3、研究猪苓多糖(polyporus polysaccharide, PPS)通过HuR介导的转录后调节途径调控T24细胞BCL-2基因的表达T24细胞常规培养后分4组,对照组(正常培养的细胞,未做任何处理)、PPS低剂量组(加入50μg/mL PPS)、PPS中剂量组(加入.100μg/mL PPS)、PPS高剂量组(加入200μg/mL PPS)。在进行细胞药理实验前,采用MTT法绘制细胞生长曲线,以掌握T24细胞的生长特性和确定合理的细胞接种密度,然后分别用Hoechst染色、流式细胞分析技术检测不同浓度PPS对T24细胞凋亡的影响。研究PPS对T24细胞BCL-2基因表达的影响：用Western blotting和RT-PCR技术,分别检测不同浓度PPS对T24细胞BCL-2蛋白和BCL-2 mRNA的影响。研究PPS对T24细胞BCL-2mRNA稳定性的影响：用Actinomycin D阻抑转录,用RT-PCR测定各处理组细胞BCL-2 mRNA的相对表达量。分别以各组0h的mRNA含量为100%,得到2、4、6h各时间点相对Oh的mRNA剩余含量,检测BCL-2mWh的半衰期,以确定PPS对T24细胞BCL-2 mRNA稳定性的影响。研究PPS对HuR在T24细胞内定位的影响：各实验组细胞经不同浓度PPS处理24 h后,收集细胞,分段提取胞浆、胞核蛋白,Western blotting分析胞浆、胞核HuR蛋白的表达,以确定PPS对HuR在T24细胞内定位的影响。研究PPS对T24细胞内HuR-mRNA复合物中BCL-2mRNA的含量：裂解细胞制备含mRNP的裂解液,预清除非特异性抗原,用抗体包被琼脂糖徽球,免疫沉淀后进行沉淀产物mRNA的纯化和目的基因的PCR扩增,以确定PPS对T24细胞内BCL-2 mRNA与HuR结合的影响。4、麦角甾醇通过HrR介导的转录后调节途径调控T24细胞cyclin D1基因的表达T24细胞常规培养后分3组,实验分3组,对照组(正常培养的细胞,未做任何处理)、0.5 μ M麦角甾醇组、1μM麦角甾醇组。分别用MTT染色、流式细胞分析技术检测麦角甾醇对T24细胞增殖的影响；用Western blotting和RT-PCR技术,分别检测不同浓度麦角甾醇对T24细胞cyclin D1蛋白和cyclin D1mRNA的影响。研究麦角甾醇对T24细胞cyclin D1 mRNA稳定性的影响：用Actinomycin D阻抑转录,用RT-PCR测定各处理组细胞cyclin Dl mRNA的相对表达量。分别以各组Oh的mRNA含量为100%,得到2、4、6h各时间点相对Oh的mRNA剩余含量,检测cyclin D1 mRNA的半衰期,以确定麦角甾醇对T24细胞cyclin D1 mRNA稳定性的影响。研究麦角甾醇对HuR在T24细胞内定位的影响：各实验组细胞经不同浓度麦角甾醇处理48 h后,收集细胞,分段提取胞浆、胞核蛋白,Western blotting分析胞浆、胞核HuR蛋白的表达,以确定麦角甾醇对HuR在T24细胞内定位的影响。研究麦角甾醇对T24细胞内HuR-mRNA复合物中cyclin D1 mRNA的含量：裂解细胞制备含mRNP的裂解液,预清除非特异性抗原,用抗体包被琼脂糖徽球,免疫沉淀后进行沉淀产物mRNA的纯化和目的基因的PCR扩增,以确定麦角甾醇对T24细胞内cyclin D1 mRNA与HuR结合的影响。结果：1、HuR过表达可提高T24细胞BCL-2 mRNA的稳定性,增加BCL-2 mRNA和蛋白的表达。HuR过表达后,空白对照组与阴性对照组比较,BCL-2 mRNA衰减速度、BCL-2 mRNA和蛋白的表达量没有明显变化；与空白对照组和阴性对照组相比,HuR过表达组BCL-2 mRNA衰减速度明显减慢,BCL-2mRNA和蛋白的表达量明显增高(P<0.05)。2、HuR沉默可降低T24细胞BCL-2 mRNA的稳定性,减少BCL-2 mRNA和蛋白的表达。HuR沉默后,空白对照组与阴性对照组比较,BCL-2 mRNA衰减速度、BCL-2 mRNA和蛋白的表达量没有明显变化；与空白对照组和阴性对照组相比,HuR沉默组BCL-2 mRNA衰减速度明显加快,BCL-2 mRNA和蛋白的表达量明显降低(P<0.05)。3、PPS可通过HuR介导的转录后调节途径调控T24细胞BCL-2基因的表达。(1)PPS可促进T24细胞凋亡。细胞在不同因素作用24 h后,用Hoechst 33342染色,对照组细胞核呈均匀染色,PPS低剂量组与对照组没有明显差别,PPS中、高剂量组可见部分细胞染色质浓缩状态,胞核浓染,为细胞凋亡的形态。不同浓度PPS作用T24细胞24 h后,用Annexin V-FITC/PI双染T24细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,与对照组相比,PPS低剂量组与对照组没有明显差别,PPS中、高剂量组早期凋亡率与对照组相比明显增加(P<0.05)。(2)PPS可降低T24细胞BCL-2蛋白表达量。PPS作用于T24细胞24h后,与对照组比较,PPS低剂量组与对照组没有明显差别,PPS中、高剂量组BCL一2蛋白表达明显减少(P<0.05)。(3)PPS可降低T24细胞BCL-2 mRNA表达量。荧光定量RT-PCR检测显示,与对照组比较,PPS作用于T24细胞24 h后,PPS低剂量组与对照组没有明显差别,PPS中、高剂量组BCL-2 mRNA表达明显减少(P<0.05)。(4)PPS可降低T24细胞BCL-2 mRNA稳定性。不同浓度PPS作用24h后,用放线菌素D终止mRNA的转录,分别于0h,2h,4h,6h测mRNA的含量,绘制衰减曲线,与对照组比较,PPS低剂量组与对照组BCL-2 mRNA稳定性没有明显差别,PPS中、高剂量组BCL-2 mRNA稳定性明显下降(P<0.05)。(5)PPS可减少T24细胞HuR由胞核向胞浆的移位。不同浓度PPS作用24h后,各组细胞总的HuR蛋白比较,没有明显差异,各实验组与对照组胞浆HuR蛋白比较,PPS低剂量组没有明显变化,PPS中、高剂量组表达明显减少(P<0.05)；各实验组与对照组胞核HuR蛋白比较,PPS低剂量没有明显变化,PPS中、高剂量组表达明显增加(P<0.05)。(6)PPS可降低T24细胞内BCL-2mRNA与HuR的结合量。与对照组比较,PPS作用于T24细胞24h后测定与HuR结合的BCL-2 mRNA含量,与对照组比较,PPS低剂量组没有明显差别,PPS中、高剂量组表达明显减少(P<0.05)。4、麦角甾醇可通过HuR介导的转录后调节途径调控T24细胞cyclin D1基因的表达。与对照组比较,麦角甾醇作用后,T24细胞增殖明显抑制(P<0.05), cyclin D1 mRNA稳定性降低(P<0.05),cyclin D1 mRNA及蛋白表达减少(P<0.05), HuR总蛋白没有明显变化,但胞浆HuR蛋白表达下降(P<0.05),胞核HuR蛋白表达升高(P<0.05),免疫共沉淀显示cyclin D1 mRNA与HuR结合的降低(P<0.05)。结论：猪苓可通过其活性成分猪苓多糖和麦角甾醇发挥抗膀胱癌的作用。猪苓多糖可促进膀胱癌T24细胞凋亡,该作用可通过HuR介导的转录后调节途径降低T24细胞BCL-2基因的表达实现；麦角甾醇可抑制T24细胞增殖,该作用可通过HuR介导的转录后调节途径降低T24细胞cyclin D1基因的表达实现。