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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)与肝癌(HCC)的发生发展密切相关,乙肝病毒X开放读码框编码的X蛋白(HBx)作为反式激活因子在肝癌的发生中发挥重要的作用。但是,HBx致癌作用的分子机理仍不十分清楚。在肝癌组织中发现HBx基因普遍存在点突变和缺失突变,频率高达70%,但其作用不清。本研究为了进一步阐明HBx及其突变体在肝癌细胞中的作用和分子机制,从信号传导途径等方面探讨了野生型HBx促进肝癌细胞生长的分子机制；应用PCR技术从肝癌患者的癌组织和癌旁组织中筛选新的X基因突变体,并对已发现的HBx羧基端缺失突变体(命名为HBx△127)促进肝癌细胞生长的分子机制进行深入细致的研究。本论文从以下三个方面对HBx作用的分子机制进行了研究,主要研究内容如下：第一部分：HBx促进肝癌细胞增殖信号传导途径研究本研究探讨了5-脂氧合酶(5-lipoxygenases,5-LOX)在HBx促进肝癌细胞增殖中的作用。应用稳定表达HBx的人肝癌细胞系HepG2-X和H7402-X,通过real-time PCR、免疫印迹和酶联免疫分析等方法检测5-LOX表达水平,结果显示HBx能够上调5-LOX的表达,其细胞培养液中5-LOX代谢产物LTB4的含量增加；在此基础上,探讨HBx上调5-LOX表达的分子机制。结果显示,Nuclear factor-kappa B (NF-κB)的特异性抑制剂PDTC和NF-κB siRNA干扰片段可明显降低5-LOX的表达,表明HBx通过NF-κB上调了5-LOX的表达；然后,应用5-LOX的特异性抑制剂MK886和5-LOX siRNA处理HepG2-X (or H7402-X)细胞,发现5-LOX通过正反馈促进NF-κB的表达。因此,本研究结果提示,HBx通过5-LOX和NF-～B之间的正反馈调节环促进和维持肝癌细胞的生长。第二部分：新的乙肝病毒X基因突变体的筛选为了发现新的HBx基因突变,我们从60例肝癌病人的癌组织和癌旁组织中筛选HBx基因新的突变体。结果显示,44例癌组织和癌旁组织里均可检测到HBx基因,阳性率为73.3%；其中28例癌组织中HBx基因发生了突变(63.6%),27例的癌旁组织里HBx基因发生突变(61.3%)；测序结果显示,癌组织和癌旁组织中HBx点突变分别有35种不同类型,其中癌组织中HBx蛋白第30,33,38,144位氨基酸为热点突变位点,而第30,33和38位氨基酸伴随有组合突变(突变率30%),该突变体目前未见报道；癌旁组织中HBx蛋白的第31,40,87,94位氨基酸为热点突变位点,第94位氨基酸点突变(突变率11%)目前未见报道。在此基础上,对癌组织中发现的HBx组合突变体的功能进行了初步研究,通过报告基因检测了上述HBx组合突变体对NF-κB、hTERT、AP-1和survivin启动子转录活性的影响,结果显示第30,33和38位HBx的组合突变体与野生型的HBx蛋白结果相同,提示该组合突变并未影响其功能改变。第三部分：HBx突变体HBx△127促进肝癌细胞增殖信号途径研究我们实验室前期研究发现HBx△127与野生型HBx相比具有更强的促进肝癌细胞增殖的能力,但其分子机制尚不清楚。为了探讨HBx△127在肝癌发生、发展中的作用,本研究首先应用人肝癌细胞系HepG2和H7402,通过基因转染和G-418筛选等方法,获得了稳定转染HBx△127的肝癌细胞系,分别将其命名为HepG2-X△127和H7402-X△127;在此基础上,探讨了HBx△127对脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase, FAS)和固醇调节元件结合蛋白-lc (Sterol regulatory element binding protein 1c, SREBP-1c)的影响。应用real-time PCR、荧光素酶报告基因、免疫印迹和酶联免疫分析等方法,发现HBx△127能够上调FAS和SREBP-1c的启动子活性及SREBP-1c的表达；进一步研究发现,5-LOX的特异性抑制剂MK886可明显抑制上述上调作用,提示HBx△127可通过5-LOX上调FAS的转录活性和SREBP-lc的表达,进而促进肝癌细胞的增殖；然后,我们进一步观察了HBx△127对5-LOX代谢产物LTB4的影响。应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测,发现HepG2-X△127和H7402-X△127细胞条件培养液中LTB4的含量与对照细胞组相比明显增加。当在培养液中外加100nM LTB4时,荧光素酶报告基因检测结果显示,FAS的启动子活性明显增强。最后,应用FAS的特异性抑制剂cerulenin处理HepG2-X△127和H7402-X△127细胞,5-LOX的表达受到抑制,提示FAS可调节5-LOX的表达。流式细胞术检测结果证实,FAS和5-LOX具有促进肝癌细胞增殖的作用。因此,本研究结果表明HBx△127具有促进和维持肝癌细胞生长的作用,与FAS和5-LOX之间的正反馈调节环有关。综上所述,本研究为深入揭示HBx的致癌机理提供了新的实验依据,可进一步丰富HBx致癌的分子机理,对于肝癌的预防及治疗具有重要的理论价值。