研究背景乳腺癌(breast cancer,BC)是女性发生率和死亡率最高的恶性肿瘤。在中国发达城市BC是第二大危害妇女生命安全的恶性肿瘤,仅次于肺癌。BC恶性程度高、易转移,其发病原因目前已经确认与BC阳性家族遗传基因相关,目前己发现的相关基因有BRCA-1和BRCA-2基因。BC的发生往往伴随组织血液中非编码RNA的差异表达,并且这些非编码RNA(lncRNA)可能具有关键功能。然而,BC发病机制受到多方面影响,确切机制至今仍不明确。BC是一种富血供肿瘤。在中晚期,由多支动脉对BC进行血液供给并营养肿瘤,导致癌症分期增加。临床上使用放疗、化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗等手段治疗BC,但是对于中晚期患者以上方法局限性明显。介入栓塞肿瘤供血动脉是目前常见的治疗实体肿瘤的方法,疗效肯定。目前,局部区域动脉插管栓塞乳腺肿瘤供养动脉是针对BC治疗研究出的一种新的有效方法,此法对原发病灶瘤块的供血动脉血管进行切断和阻塞,降低肿瘤的供血量,且对肿瘤的新生血管的生长具有抑制作用,与此同时该方法可以提高局部化疗药物浓度,从而使原发灶肿瘤细胞增殖迅速减慢,增加凋亡,并且使周围组织缺血、坏死,使病变局限,边界及界限清楚,从而降低肿瘤的分期。然而,由于BC类型较多与发病机制复杂,导致BC动脉介入栓塞化疗(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)时机及化疗后手术的时机选择困难。因此需要深入研究BC分子机制,以发现理想的BC的TACE生物标记物。目前可用于BC的TACE药物主要有蒽环类药物、长春碱类药物、铂类药物、紫杉类药物、烷化剂及抗代谢药物。化疗药物对于肿瘤细胞而言其毒性均呈浓度依赖性。BC的TACE药物种类和剂量虽无统一标准,但须进行严格筛选。配选出杀伤力强且副作用弱的药物组合是当下临床研究的热点。吡柔比星是新型蒽环类药物,可以通过阻碍细胞DNA复制对细胞进行杀伤,并且可以对BC、膀胱癌、结肠癌的血管生成造成影响。而丝裂霉素使细胞的DNA解聚,同时阻碍DNA的复制,在多种癌症包括BC的治疗中被长期应用。吡柔比星与丝裂霉素均为理想的TACE药物。尽管TACE在多种癌症中疗效稳定,但是专家学者们在晚期BC的TACE治疗时机选择以及TACE后手术切除时机筛选等方面仍持有分歧。因此本研究通过进一步深入研究BC发生发展以及TACE治疗的内在分子机制,为合适的TACE化疗药物组合和反映BC的TACE疗效及TACE后手术时机的分子标记物的筛选做出理论性贡献,进一步推动BC的TACE之实践与理论的发展。第一部分BC动脉栓塞结合吡柔比星联合丝裂霉素介入化疗的临床疗效目的观察栓塞乳腺肿瘤动脉结合吡柔比星(pirarubicin,THP)与丝裂霉素(mitomycin,MMC)局部灌注在不可手术切除的中晚期BC的临床疗效。方法1.临床基本资料郑州大学附属肿瘤医院于2013年6月~2016年6月收治的40例局部晚期BC患者,随访资料完整,均经穿剌活检或手术病理确诊。2.TACE方法实验组(TACE):20例,患者取仰卧位、乳腺肿瘤组织各供血分支行化疗药物(THP 60~80 mg、MMC 10 mg)灌注。药物分别缓慢推注10 min。肿瘤栓塞过程:插管至乳腺肿瘤供血动脉。栓塞至肿瘤动脉供血完全闭塞。对照组(CHEM):20例,化疗药物给予全身静脉化疗THP 60~80 mg、MMC 10 mg、5-FU 1 g。3.结果判定标准参照实体瘤的疗效评价标准(response evaluation criteria in solid tumors,RECIST)判定疗效,对比两组患者临床化疗效果。完全缓解(complete response,CR)指所有目前病灶消失,至少维持4周;部分缓解(partial response,PR)指基线病灶最大径之和至少减少30%,至少维持4周;病情稳定,病变稳定(stable disease,SD)指基线病灶最大径之和有减少但未达到PR或有增加但未达到PR。病情进展(progressive disease,PD)指基线病灶最大径之和至少增加20%或有新病灶出现。其中CR和PR为有效,即总有效=CR+PR。NC及PD为无效。4.肿瘤进展情况及生存率随访经TACE后效果好,行手术切除。所有患者随访观察治疗后3个月、9个月、12个月、18个月患者病灶的进展情况和生存率。结果1.TACE临床疗效20例0例行TACE的BC患者在TACE后2~3 d局部肿块与腋窝淋巴结体积减小、变软;组织活动度变强、皮肤色泽变淡,癌块与胸壁黏连处的活动度增加。TACE组临床完全缓解(CR)5例,临床部分缓解(PR)12例,病情无变化(NC)3例,进展(PD)0例,总有效率为85%。CHEM临床完全缓解(CR)1例,临床部分缓解(PR)10例,病情无变化(NC)9例,进展(PD)0例,总有效率为55%。二者比较差异有统计学意义(P=0.031,χ2=7.87)。2.肿瘤组织学变化CHEM组术后解剖标本可观察到癌块与周围组织分界较不明显,组织学检验发现浸润性癌,组织有明显退变,脉管内可见明显癌栓,左锁骨上淋巴结未见明确癌。与CHEM组相比,TACE组患者手术后解剖标本可观察到于癌块与周围组织分界面较明显,且可观察到灰白色切面和点状坏死,癌块内发现大部分血管分布减少。在显微镜下观察到TACE后左锁骨上淋巴结未见明确癌癌组织有片状坏死。在片状坏死周围可发现炎性浸润和增生的纤维组织,判定内皮细胞增生。3肿瘤进展情况及生存率随访结果随访至2017年6月31日,随访时间3~18个月,死亡6例,其中3例死于肺转移,2例死于肝转移,l例死于脑转移。CHEM组患者3、9、12、18个月时生存率分别为100.0%(20/20)、90%(18/20)、85%(17/20)、80%(16/20),TACE组患者3、9、12、18个月时生存率分别为100.0%(20/20)、90%(18/20)、90%(18/20)、90%(18/20),两组患者3和9个月时生存率无差异。两组患者12和18个月时生存率比较差异有统计学意义(P=0.003,P=0.001)结论TACE用于晚期不可切除BC患者治疗具有应用潜力,其临床效果仍需进一步加大样本量进行研究,TACE治疗可显著抑制BC肿瘤生长、血管生成与转移,且不良反应较少。第二部分不同浓度吡柔比星联合丝裂霉素处理对体外BC细胞的影响目的探索不同浓度吡柔比星联合丝裂霉素对BC细胞增殖活性、小管形成能力以及迁移及侵袭能力的作用,为探索TACE的分子靶标提供实验基础。材料与方法1.常规培养BC细胞系MCF-7(原位ER阳性BC细胞系,恶性程度低)和MDA-MB-231(高转移性BC细胞)。2.利用MTT试剂盒法检测细胞悬液OD值(570 nm的吸光度)变化,从而研究不同浓度的联合用药对BC细胞增殖的影响。以不影响细胞生长为准,确定药物使用的时间浓度。最终选择适宜区间内高剂量和低剂量两种剂量。3.检测DNA含量对细胞周期进行分析。收集细胞使用碘化丙啶对细胞进行染色,并使用FACS Calibur Flow Cytometer对G0/G1、S以及G2/M期的细胞中DNA含量进行检测。4.Caspase3活性检测确定细胞凋亡。药物处理细胞,离心洗涤后加入裂解液,继续离心,取蛋白上清液,加入检测缓冲液与Ac-LEHD-pNA,避光反应后检测结果。5.小管形成实验。将Matrigel基质胶铺于96孔板上接种BC细胞。维续培养8 h后,置于200目显微镜下,拍照观察管腔形成情况。6.细胞迁移能力检测。使用划痕实验检测BC细胞在药物处理24 h后的迁移能力变化。7.细胞侵袭能力检测,使用Transwell小室检测BC细胞在药物处理24 h后的侵袭能力变化。结果1.MTT实验筛选吡柔比星与丝裂霉素联合处理最佳时间为24 h,选取吡柔比星2.5μg/ml以及丝裂霉素1μg/ml作为低浓度处理,选取吡柔比星10μg/ml以及丝裂霉素5μg/ml作为高浓度处理。2.对比Control,低剂量组,高剂量组G1期的细胞数增加(P=0.022),S期的细胞数减少(P=0.012),而且高剂量组比低剂量组G1期的细胞数增加与S期的细胞数减少更显著(P=0.018)。3.对比Control,低剂量组,高剂量组的Caspase3活性显著升高(P=0.017),且高剂量组比低剂量组效果显著(P=0.031)。4.对比Control,低剂量组,高剂量组小管形成被显著抑制(P=0.016),且高剂量组比低剂量组效果显著((P=0.033)。5.对比Control,低剂量组,高剂量组侵袭迁移能力被显著抑制(P=0.017),且高剂量组比低剂量组效果显著(P=0.031)。结论高浓度吡柔比星联合丝裂霉素对BC细胞的增殖、凋亡、血管生成、迁移及侵袭能力的影响均大于低浓度的药物。第三部分吡柔比星联合丝裂霉素对BC细胞血管生成相关基因及非编码RNA的影响目的探索不同浓度吡柔比星联合丝裂霉素对BC细胞中血管生成相关基因及非编码RNA的影响。材料与方法1.组织来源。BC组织标本来源于前述(第一部分)40例行BC根治术患者化疗后的活检病例组织蜡块。2.常规培养BC细胞系MCF-7和MDA-MB-231。使用低浓度和高浓度吡柔比星与丝裂霉素化疗药物处理细胞。3.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BC组织中血管生成标志基因VEGF、EGFR、cyclin D1、MMP2表达。检测BC相关长链非编码RNA的表达以及microRNA的表达:ANRIL、BC016831、HIF1A-AS2、IGKV、LINC00052、MEG3、RP11-434D9.1、UCA1、let-7a、miR-21、miR-23、miR-29a、miR-124、miR-148a、miR-152、miR-206、miR-449a、miR-1266。检测不同处理组的BC细胞中以上基因与非编码RNA的表达以及microRNA的表达变化。4.使用Western blot检测BC组织和细胞中BRCA-1与BRCA-2、VEGF、EGFR、cyclin D1,MMP2的表达变化。结果1组织中基因qRT-PCR检测结果。对比化疗前,常规化疗20例组织中20例组织中VEGF下调8例、EGFR下调7例、cyclin D1下调3例、MMP2下调5例。而化疗栓塞20例组织中中VEGF下调16例、EGFR下调14例、cyclin D1下调14例、MMP2下调15例。对比全身静脉化疗,化疗栓塞组织中lncRNA MEG3显著上调(P=0.001),miR-1266明显下调(P=0.000)。2细胞中的qRT-PCR检测结果。对比Control组,低浓度与高浓度组VEGF、EGFR、cyclin D1、MMP2、miR-1266的水平显著下调(P<0.05),高浓度化疗药物处理下VEGF、EGFR、cyclin D1、MMP2、miR-1266的水平下调比低浓度明显(P<0.05)。低浓度与高浓度组lncRNA MEG3显著上调(P<0.05),高浓度效果强于低浓度(P<0.05)。3蛋白质表达水平变化Western blot检测BC组织中基因表达变化,对比化疗前,常规化疗20例组织中VEGF下调6例、EGFR下调7例、cyclin D1下调5例、MMP2下调4例。而化疗栓塞20例组织中VEGF下调13例、EGFR下调14例、cyclin D1下调12例、MMP2下调9例。在BC细胞中,对比Control组,低浓度与高浓度组VEGF、EGFR、cyclin D1、MMP2的水平显著下调(P<0.05),高浓度化疗药物处理下VEGF、EGFR、cyclin D1,MMP2的水平下调比低浓度明显(P<0.05)。4相关性研究结果化疗栓塞组中BRCA-1、BRCA-2基因分别与lncRNA MEG3呈负相关。药物处理细胞中,BRCA-1、BRCA-2基因分别与lncRNA MEG3呈负相关。在组织与细胞中BRCA-1、BRCA-2基因分别与miR-1266呈现正相关。结论LncRNA MEG3在BC化疗栓塞后表达上调明显,其与BC标志基因呈负相关。miR-1266在BC化疗栓塞后表达下调明显,与BC标记基因呈正相关。预示LncRNA MEG3与miR-1266可能参与BC发展过程,可作为化疗栓塞动脉栓塞的候选标志物。第四部分吡柔比星联合丝裂霉素介导抗BC血管新生的体外机制研究目的探索吡柔比星联合丝裂霉素调控BC细胞血管生成的机制。材料与方法1常规培养BC细胞系MCF-7和MDA-MB-231。使用低浓度和高浓度吡柔比星与丝裂霉素化疗药物处理细胞。2 MEG3过表达慢病毒载体构建,MEG3低表达慢病毒载体构建,miR-1266过表达载体构建3 qRT-PCR检测MEG3与miR-1266的水平变化4小管生成实验。MEG3过表达对无处理BC细胞血管生成的影响。MEG3低表达对高浓度化疗药物处理的BC细胞血管生成影响5 Western blot检测内皮生长因子VEGF、EMT相关标记物MMP2、N-cadherin、Twist1的蛋白水平变化6 LncRNA与miRNA靶向关系生物系信息学预测。应用在线数据库综合预测MEG3与miR-1266的碱基互补配对关系。7双荧光素酶报告基因实验探索miR-1266与MEG3的结合情况8 Pull down实验确认MEG3与miR-1266结合情况结果1成功构建稳定高表达MEG3的慢病毒载体,MEG3的沉默载体,以及miR-1266过表达载体。2 MEG3过表达显著抑制BC细胞的血管生成及VEGF的表达(P=0.028)。低表达MEG3逆转高浓度化疗药物对BC细胞血管生成的抑制作用(P=0.023)。3 MEG3过表达显著抑制BC上皮间质转化信号表达MMP2、N-cadherin、Twist1的水平(P<0.05)。MEG3低表达显著减缓高浓度化疗药物阻碍BC细胞上皮间质转化标记物MMP2、N-cadherin、Twist1的表达(P<0.05)。4 MEG3过表达显著抑制miR-1266的水平(P=0.001)5生物信息学分析以及双荧光素酶报告基因分析发现miR-1266与MEG3具有直接结合关系。6 Pull down研究确认在BC细胞中lncRNA MEG3直接调控miR-1266的水平。7 miR-1266过表达显著缓解因高浓度化疗药物对BC上皮间质转化和血管生成的抑制作用。结论LncRNA MEG3是潜在的BC化疗栓塞的分子标志物,LncRNA MEG3/miR-1266是化疗栓塞影响BC血管生成的重要机制之一。