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背景:糖尿病肾病作为糖尿病中严重的微血管并发症之一,给家庭和社会带来了巨大的负担。肾小球肥大和超滤是糖尿病肾病的早期病变,而肾小球系膜细胞在这些变化的发病机制中处于中心位置。同时我们课题组在既往研究中发现,在糖尿病肾病的发病机制中内质网应激发挥着重要的作用,葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是其关键标志蛋白。值得关注的是,线粒体与内质网作为细胞中非常重要的细胞器,两者之间存在着结构与功能的密切关联。更有大量研究表明在荧光显微镜下能够看到内质网与线粒体之间存在相互偶联的膜组分,称之为线粒体-内质网膜。在这个偶联区域形成高浓度的Ca2+微区,与钙信号调控、线粒体形态调控、内质网应激都有密切联系。这种物理结构偶联使得内质网应激与线粒体功能障碍之间互相影响,互为因果。因此有研究者推测,线粒体功能障碍与内质网应激共同成为糖尿病肾病发病的关键因素之一。但目前,关于该领域的研究较少。线粒体-内质网结构偶联的新近发现,为探索糖尿病肾病的发病机制提供了新思路。同时,在以往的研究中我们发现,益气养阴中药对糖尿病肾病早期肾组织的内质网应激有一定积极的影响。其中,生脉饮便是益气养阴的典型方剂之一,临床常被用于治疗糖尿病及糖尿病肾病。目的:采用益气养阴的经典方剂—生脉饮作为干预药物,初步探讨生脉饮对内质网应激条件下大鼠肾小球细胞(HBZY-1)内线粒体-内质网结构偶联相关蛋白的影响,以期明确其具体的作用机制,为以后更好地指导临床及找到更多的肾脏保护的药物提供借鉴作用。方法:运用内质网应激激动剂——毒胡萝卜素(TG)探讨生脉注射液在内质网应激条件下,大鼠肾小球系膜细胞中线粒体和内质网的形态变化,以及对葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、线粒体融合蛋白1(Mfn1)和线粒体融合蛋白2(Mfn2)的基因和蛋白表达的影响。具体方法如下:(1)通过CCK-8法确定不同浓度刺激物(包括TG和生脉注射液)干预一定时间后对HBZY-1细胞是否有毒性作用。(2)HBZY-1 细胞以 0.05μM、0.1μM、0.2μMTG 作用 24h 后,通过相差显微镜观察线粒体及内质网的形态变化,以明确TG对HBZY-1细胞中内质网及线粒体的形态结构的影响。(3)采用Real-time PCR方法检测GRP78的表达水平,研究不同浓度、不同时间的TG作用诱导HBZY-1细胞内质网应激的情况,以探索HBZY-1细胞内质网应激的相关模型。(4)将HBZY-1细胞分为正常组、模型组(TG组)及给药组(TG与生脉注射液联用组),正常组用常规培养基培养,模型组用0.1μM的TG刺激,给药组用0.lμM的TG以及6μl/ml的生脉注射液刺激,上述各组培养24h后,通过激光共聚焦显微镜观察正常组、模型组及给药组细胞线粒体及内质网形态结构的变化,以明确生脉注射液是否对内质网应激下的HBZY-1细胞中内质网及线粒体起到一定的保护作用。(5)通过Real-time PCR及Western Blot方法检测实验各组作用24h后HBZY-1细胞中内质网应激指标GRP78的基因及蛋白的表达情况,以明确生脉注射液对内质网应激下的HBZY-1细胞的内质网应激水平是否具有调控作用。(6)通过Real-time PCR及Western Blot方法检测实验各组作用24h后HBZY-1细胞中线粒体融合相关指标Mfn1与Mfn2的基因及蛋白的表达情况,以明确生脉注射液对对内质网应激下的HBZY-1细胞的线粒体融合障碍是否具有调控作用。结果:(1)CCK-8结果显示,实验所用的TG在各浓度24h组及0.2μM、0.4μM浓度48h组与正常组的细胞吸光度相比,差异不具有统计学意义(P>0.05);而各浓度36h组及0.8μM浓度48h组与正常组的细胞吸光度相比,差异有统计学意义(P<0.05)。实验所用生脉注射液在各浓度24h组及8μl/ml浓度36h组与正常组相比,差异不具有统计学意义(P>0.05):而各浓度36h组(除8μl/ml浓度)及各浓度48h组与正常组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)相差显微镜结果显示,0.05μM、0.1μM及0.2μM TG作用24h后HBZY-1细胞随着浓度的增高其增殖受到一定程度的抑制,且细胞内线粒体及内质网结构发生改变,细胞边界模糊,尤其是内质网结构变化明显。(3)Real-timePCR 结果显示,0.05μM、0.1μM及 0.2μMTG 分别作用于HBZY-1细胞24h、36h及48h(0.05μM浓度,48h除外)均可引发内质网应激指标GRP78的mRNA表达上调,并有一定的浓度及时间依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。但若是TG的浓度过高,可直接引起细胞死亡,反而使GRP78的mRNA表达降低。(4)激光共聚焦显微镜结果显示,与正常组相比,0.1μM TG作用于HBZY-1细胞24h可引起细胞中内质网及线粒体结构的破坏;而给予6μl/ml的生脉注射液可显著改善内质网及线粒体结构破坏的现象,一定程度起到保护内质网及线粒体结构的作用。(5)Real-time PCR 及 Western Blot 结果显示,与正常组相比,0.1 μM TG作用于HBZY-1细胞24h可诱发内质网应激指标GRP78的基因和蛋白表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05);而给予6μl/ml的生脉注射液可显著降低GRP78的基因和蛋白表达水平,差异均具有统计学意义(P<0.05)。(6)Real-time PCR 及 Western Blot 结果显示,与正常组相比,0.1 μM TG作用于HBZY-1细胞24h可诱发线粒体融合相关指标Mfn1的基因和蛋白表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05);而给予6μl/ml的生脉注射液可显著降低Mfn1的基因和蛋白表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。但对于Mfn2而言,通过造模药刺激以及治疗药物的干预,仅可使其基因表达发生改变(即造模后Mfn2的mRNA的表达上调,生脉注射液干预后表达下降,差异具有统计学意义);而对Mfn2的蛋白表达没有影响。结论:(1)生脉注射液对HBZY-1细胞的增殖具有一定的抑制作用,成一定的时效和量效的依赖。(2)生脉注射液可改善内质网应激条件下HBZY-1细胞中内质网及线粒体结构破坏的现象,一定程度上起到保护内质网及线粒体结构的作用。(3)一定浓度和一定时间内,TG能够诱发HBZY-1细胞的内质网应激,并呈浓度依赖性。但若是TG的浓度过高,可直接引起细胞死亡,反而无法诱发内质网应激。(4)生脉注射液可显著改善内质网应激条件下HBZY-1细胞的内质网应激水平,同时一定程度上调控线粒体融合水平,且在一定浓度范围内呈浓度依赖性。