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microRNAs (miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20～25个核苷酸。近年来研究表明miRNAs在生物学的各个过程中发挥了极其重要的作用：如细胞和个体发育、器官形成、造血生成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、细菌与病毒的感染和机体防御、炎症的发生发展等。同样,microRNAs在免疫系统中亦有很好的研究。已有的研究表明microRNAs在T细胞、B细胞、DC、NK细胞分化发育中均发挥重要作用,从而参与了机体先天免疫和获得性免疫应答。Rafael Casellas实验室的研究结果表明niR-34a在各种免疫细胞中呈现出不同的表达水平,由此我们推测miR-34a可能在淋巴细胞的分化发育中发挥重要作用。为进一步探讨miR-34a在淋巴细胞分化发育中的作用,在本课题中,我们主要通过建立miR-34a嵌合小鼠模型和miR-34a转基因小鼠模型并应用这两种动物模型来探讨miR-34a在淋巴细胞分化发育中的作用。首先,我们构建了miR-34a过表达质粒pMDH 1-PGK-GFP-miR-34a,并通过qPCR、流式分析等验证了miR-34a过表达质粒pMDH 1-PGK-GFP-miR-34a的成功表达,在此基础上,我们一方面制备了miR-34a的逆转录病毒,感染小鼠的骨髓干细胞,建立了miR-34a的嵌合小鼠模型,通过PCR及FACS验证了小鼠模型的成功构建；另一方面,我们将pMDH 1-PGK-GFP-miR-34a用Hind Ⅲ酶切线性化,经显微注射到受精卵细胞中制备了miR-34a转基因小鼠模型。经FACS分析发现：无论在嵌合小鼠中,还是在转基因小鼠模型中,过表达了miR-34a后,无论是在骨髓还是在脾脏中,B细胞的数目均有显著减少,此结果与Baltimore实验室研究结果一致,进一步说明了嵌合小鼠模型和转基因小鼠模型的构建成功。进一步研究发现,过表达miR-34a后,无论是在嵌合模型还是在转基因模型中,髓系来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)都显著高于其在正常小鼠体内的比例,且在转基因小鼠模型中发现MDSCs的绝对数升高。通过BrdU染色研究发现BM和脾脏中BrdU阳性细胞比例未见显著差异,这一结果提示miR-34a并不影响MDSCs细胞的自我更新或增殖。进一步分析MDPs等早期分化祖细胞发现：和WT小鼠比较,MDPs, GMPs等祖细胞比例未发现有显著差异,但用Annexin Ⅴ染色,经FACS检测发现,转基因小鼠的MDSCs的凋亡明显减少,这提示着miR-34a很可能是通过减少MDSCs的凋亡而使其百分比和绝对数增高。为进一步分析miR-34a抑制MDSCs凋亡的作用机制,寻找1niR-34a在MDSCs中的靶基因,我们应用miRWalk软件预测、荧光素酶报告系统检测以及实时定量PCR及Western-blot等研究发现, miR-34a可能通过作用于N-myc等来调控MDSCs的发育。为进一步探讨miR-34a是否影响MDSCs的功能,我们应用流式细胞仪分选MDSCs,并应用实时定量PCR检测发现：和WT MDSCs相比,脾脏中niR-34a过表达的MDSCs产生高水平的TNF、iNOS、IL-17,而Arg、TGF-β的表达较低。但在BM MDSCs中miR-34a过表达后TNF、iNOS、IL-6、IL-10、IL-12等表达较高。为验证这种细胞因子表达谱的变化是否影响MDSCs的功能,我们分别在miR-34a和WT小鼠中建立LLC小鼠模型,发现两组肿瘤生长并无显著差异。考虑到miR-34a同样在其他细胞中过表达,为排除其他细胞的影响,我们从miR-34a转基因模型中纯化BM MDSCs并在肿瘤注射前通过眼静脉方式注射到小鼠体内,和WT MDSCs输注组相比,miR-34a MDSCs并未显著影响LLC肿瘤在体内的生长。这些结果提示尽管miR-34a改变了MDSCs细胞因子的表达谱,但并未影响MDSCs对肿瘤生长的影响。总结我们现有研究,我们成功建立了miR-34a过表达嵌合小鼠和转基因小鼠动物模型,通过研究发现,miR-34a通过抑制N-myc等分子的表达从而抑制了MDSCs的凋亡,尽管miR-34a过表达后影响了MDSCs的细胞因子的表达谱,但并不影响MDSCs对肿瘤的生长。这一系列的研究一方面揭示了miR-34a对MDSCs分化发育及凋亡等的影响,同时,也为microRNAs在淋巴细胞的生物学行为影响提供新的依据。