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目的:非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在基因表达调节网络中发挥重要的作用,在很多细菌中已被广泛发现和研究。本研究组通过对伤寒沙门菌(S.Typhi)不同应激条件下的转录组RNA-seq的分析,发现rpo H基因对侧反向编码的RNA,命名AS-RpoH,本论文旨在对AS-RpoH进一步鉴定,并对其分子表达特性及在S.Typhi中的功能展开初步研究。方法:1.AS-RpoH分子特性分析:设计AS-RpoH特异性引物和杂交探针,用RT-PCR和Northern Blot证实AS-RpoH在S.Typhi中的表达存在;用5′RACE实验和RT-PCR探究AS-RpoH的转录起始和可能的终止位点,分析其分子全长和基因定位。2.AS-RpoH表达特性分析:用Northern Blot和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术分析S.Typhi在不同生长时相的AS-RpoH的表达水平;用q RT-PCR分析对数期野生株(OD600 0.4)在酸、氧、高渗及热应激环境刺激下AS-RpoH的表达情况。3.分析sigma因子对AS-RpoH表达影响:选用实验室前期已经制备的sigma因子的缺失变异株(Δrpo E和Δrpo S),用q RT-PCR分析不同条件下不同缺陷株中AS-RpoH的表达特点。4.制备AS-RpoH高表达菌株:在ncRNA AS-RpoH中覆盖rpo H编码区序列处设计一对引物,引物加上NocⅠ和Xho I酶切位点。经PCR扩增AS-RpoH基因片段,通过酶切和连接,插入至p BAD/Myc-His A载体,经过酶切、PCR及测序鉴定后,将重组载体(p BAD-AS-RpoH)和空载体(p BAD/Myc-His A)电转入S.Typhi野生株中,构建高表达菌株(WT-p BAD-AS-RpoH)和空质粒对照株(WT-p BAD)。5.动力试验:制备0.3%的等渗半固体动力培养基,吸取1μL培养至对数生长期的AS-RpoH高表达菌株和对照株菌液,分别接种于动力板,37℃培养一定时间后根据细菌圈直径来比较细菌的动力差异。6.生长曲线测定:以时间为横坐标,OD600为纵坐标描制曲线,观测AS-RpoH高表达菌株和对照株在不同条件下的生长情况。7.He La上皮细胞侵袭实验:将AS-RpoH高表达菌株和对照株培养至对数期,与He La细胞共孵育,分析比较两种细菌对上皮细胞侵袭能力间的差异。8.rpo H m RNA的稳定性分析:将AS-RpoH高表达菌株和对照株培养至对数期,q RT-PCR分析rpo H m RNA的水平。结果:1.RT-PCR和Northern Blot检测发现,AS-RpoH在S.Typhi中存在表达,长约3000 nt;5′RACE结果显示转录起始点位于yhh K编码区上游411 nt处;RT-PCR结果表明AS-RpoH的转录终止位点在距离5′端3461~3508 nt;yhh K编码区探针做Northern Blot分析发现,其杂交条带与AS-RpoH表达高峰区探针杂交条带长度基本一致。2.Northern Blot和q RT-PCR结果表明,AS-RpoH在不同生长时期下的表达水平无明显差异,在酸应激下的表达水平显著下降,在热应激、氧应激和高渗应激下的表达无明显变化。3.q RT-PCR结果表明,与WT相比,Δrpo S中AS-RpoH表达下调,Δrpo E中AS-RpoH表达无变化。在氧应激和高渗应激下,WT、Δrpo S、Δrpo E中AS-RpoH表达无明显变化;在酸应激下,WT和Δrpo E中AS-RpoH表达下调,Δrpo S中AS-RpoH的表达无变化。4.成功构建AS-RpoH高表达菌株(WT-p BAD-AS-RpoH)和空质粒对照株(WT-p BAD)。5.动力实验显示,AS-RpoH高表达菌株和对照株动力无明显变化。6.生长曲线测定结果显示,不同应激下AS-RpoH高表达菌株和对照株的生长状况无明显差异。7.与对照株相比,AS-RpoH高表达菌株对He La细胞的侵袭能力减弱。8.q RT-PCR结果表明,高表达AS-RpoH可以提高rpo H m RNA的稳定性。结论:在S.Typhi中新鉴定了一个长链反义RNA AS-RpoH,其分子全长在3461~3508 nt之间,且为yhh K的3′非翻译区;rpo S有可能参与调控酸应激下AS-RpoH的表达调节;AS-RpoH能使细菌对He La细胞的侵袭能力下降,同时其可提高rpo H m RNA的稳定性。