论文部分内容阅读
研究背景呼吸道黏液是气道防御屏障的重要组成部分，在维持气道湿化、协助上皮细胞功能等方面起重要作用。但如果黏液过度分泌，可阻塞呼吸道导致严重的气流受限，这种状况常发生在许多严重的呼吸道疾病中，包括支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstruction pulmonary disease，COPD)，与这些疾病的发生发展和转归有密切关系。气道黏液包括糖蛋白、非糖蛋白类蛋白质、脂、无机盐、水等成分组成，高度糖基化的黏蛋白是气道黏液的最主要成分，痰液的黏性也由黏蛋白赋予。不论是健康个体还是气道疾病的患者，气道分泌的黏液中MUC5AC是最主要的黏蛋白成分，其后依次为MUC5B和MUC2。进一步研究气道黏蛋白表达的调控，将有助于更好了解慢性气道炎症黏液高分泌机制，为慢性气道炎症性疾病防治提供新的方向。细菌感染是气道黏液高分泌的常见因素，研究表明革兰氏阴性细菌及其胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)可以通过表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)及其下游丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路上调气道MUC5AC、MUC2的表达，但目前对LPS是否上调气道上皮细胞MUC5B的表达尚未明确，为此我们在研究LPS上调气道MUC5AC、MUC2表达的基础上，进一步探讨LPS对气道上皮细胞MUC5B表达的影响。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN)是1997年发现的具有磷酸酶活性的抑癌基因。其产物PTEN蛋白在人的上皮细胞有丰富的表达。其对磷酸化的酪氨酸和丝／苏氨酸残基均有去磷酸化作用，是一种双特异性磷酸酶，它的底物还包括磷脂，该酶对PI3K／AKT(磷脂酰肌醇3激酶／丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶)途径和MAPK途径均起负向调节作用。最新研究表明，PTEN可以下调香烟烟雾诱导的气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC的高表达，由于LPS与香烟烟雾均通过EGFR-MAPK信号通路上调粘蛋白的表达，所以我们设想PTEN也在LPS诱导的气道上皮黏蛋白表达中具有重要作用。我们采用NCI-H292细胞，给予铜绿假单胞菌脂多糖(pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharides，PA-LPS)干预细胞，检测三种主要气道黏蛋白mRNA及蛋白的表达情况，同时检测PTEN mRNA及蛋白的表达，分析两者的相关性，探讨PTEN在LPS诱导气道上皮黏蛋白表达中的意义。研究目的观察PA-LPS刺激人气道黏液上皮NCI-H292细胞后MUC5AC、MUC5B、MUC2和PTEN的mRNA表达情况，同时在蛋白水平检测黏蛋白和PTEN表达，分析黏蛋白和PTEN表达的相关性，探讨PA-LPS对人气道上皮黏蛋白表达的影响及PTEN在LPS诱导黏蛋白表达中的意义。研究方法培养人气道黏液上皮癌细胞系NCI-H292细胞，用PA-LPS干预细胞，干预24小时后抽取细胞总RNA，应用逆转录-聚合酶链反应(reverse trancription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法检测MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA和MUC2 mRNA的表达，采用免疫细胞化学方法检测细胞中MUC5AC、MUC2蛋白的表达。同样的方法从mRNA水平和蛋白水平检测PTEN的表达，分析三种黏蛋白mRNA和PTEN mRNA表达的相关性。研究结果1．干预后MUC5AC、MUC5B以及MUC2的mRNA表达水平变化：1．1 RT-PCR结果显示，LPS干预组MUC5AC mRNA表达与对照组相比明显增加，差异有显著性(p＜0.01)。1．2 RT-PCR结果显示，LPS干预组MUC5B mRNA表达与对照组相比明显增加，差异有显著性(p＜0.05)。1．3 RT-PCR结果显示，LPS干预组MUC2 mRNA表达与对照组相比明显增加，差异有显著性(p＜0.05)。2．干预后PTEN的mRNA表达水平变化：RT-PCR结果显示，LPS干预组PTEN mRNA表达与对照组相比明显减少，差异有显著性(p＜0.01)。3．干预后MUC5AC以及MUC2蛋白水平变化：3．1培养细胞爬片免疫细胞化学检测MUC5AC结果提示，MUC5AC蛋白表达于胞浆中，阳性细胞胞浆染色呈黄褐色，对照组仅少数细胞胞浆着色，LPS干预后细胞MUC5AC染色明显增强呈阳性，阳性细胞百分率与对照组相比具有显著性差异(p＜0.01)。3．2培养细胞爬片免疫细胞化学检测MUC2结果提示，MUC2蛋白表达于胞浆中，阳性细胞胞浆染色呈黄褐色，对照组细胞仅少数呈阳性着色，LPS干预后细胞MUC2染色明显增强呈阳性，阳性细胞百分率与对照组相比具有显著性差异(p＜0.01)。4．干预后PTEN蛋白水平变化：PTEN蛋白主要阳性染色位于胞浆中，极少数位于胞核和胞膜，阳性染色呈黄褐色，对照组细胞染色呈阳性，LPS干预后细胞PTEN阳性染色明显减弱，阳性细胞百分率与对照组相比具有显著性差异(p＜0.01)。5．MUC5AC、MUC5B以及MUC2的mRNA表达水平与PTEN mRNA表达的相关性分析：细胞中MUC5AC mRNA表达水平与PTEN mRNA表达呈显著负相关(r值为—0.632、p＜0.05)。MUC5B以及MUC2的mRNA表达水平与PTEN mRNA表达无明显相关性(r值分别为—0.398、—0.299，p＞0.05)。结论1．PA-LPS可明显上调人气道上皮细胞系NCI-H292细胞中三种主要黏蛋白MUC5AC、MUC5B以及MUC2的mRNA表达及MUC5AC和MUC2蛋白表达。2．PA-LPS刺激细胞后可以下调PTEN mRNA和蛋白表达水平。3．PTEN mRNA表达下调与MUC5AC mRNA表达上调之间具有显著相关性，PTEN在LPS诱导的黏液高表达中可能发挥着重要的负调节作用。