论文部分内容阅读
目的:本研究在前期工作基础上,通过建立被动型Heymann肾炎(PHN)大鼠模型,进一步探讨益气活血化湿方及其拆方对PHN模型大鼠外周血Th17/Treg含量以及对足细胞裂孔膜蛋白α-actinin-4和CD2AP的调节作用,为运用中医药治疗膜性肾病提供一定依据。方法:取雄性Wistar大鼠,制备经典的PHN模型。将造模成功的大鼠采用随机数字法分为模型组、环孢素组、益气活血化湿方全方组、益气方组、活血方组和化湿方组,每组10只,另取10只正常大鼠为空白对照组。各药物组分别灌胃给予相应药液干预,空白对照组和模型组大鼠灌胃给予等量0.9%Na Cl溶液,连续6周。分别于第0、2、4、6周对各只大鼠眼眶静脉丛采血,代谢笼收集24 h尿液。全自动生化分析仪检测血清白蛋白(Alb)、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平以及尿液样本24 h尿蛋白定量(UPRO)。干预结束后,取双侧肾脏。HE染色后光镜下观察肾组织形态学变化;Ig G免疫荧光观察肾小球Ig G沉积的变化;透射电镜下观察肾小球基底膜、足细胞及足突的形态学变化;流式细胞术检测大鼠外周血Th17/Treg的含量变化;RT-PCR、免疫组化和Western blot检测肾脏组织中足细胞裂孔膜蛋白α-actinin-4和CD2AP的m RNA及蛋白表达水平。结果:1.疗效指标:与空白对照组比较,模型组大鼠在各时间点UPRO和SCr水平明显升高(P<0.05),Alb水平明显下降(P<0.05);环孢素组第0、2周UPRO水平明显升高(P<0.05),各时间点Alb水平明显下降(P<0.05),SCr水平明显升高(P<0.05),第2、4、6周BUN水平明显升高(P<0.05);全方组第0、2、4周UPRO水平明显升高(P<0.05),各时间点Alb水平明显下降(P<0.05),SCr水平明显升高(P<0.05);拆方组各时间点UPRO水平明显升高(P<0.05),Alb水平明显下降(P<0.05),SCr水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,环孢素组第4、6周UPRO水平明显下降(P<0.05),第2、4、6周Alb水平明显下降(P<0.05),第2、4、6周SCr和BUN水平明显升高(P<0.05);全方组第6周UPRO水平明显下降(P<0.05);拆方组未见明显差异(P>0.05)。与环孢素组相比,拆方组第4、6周UPRO水平明显升高(P<0.05);各中药治疗组第2、4、6周Alb水平明显升高(P<0.05),SCr和BUN水平明显降低(P<0.05)。2.Th17/Treg:与空白对照组比较,模型组各时间点Th17明显升高(P<0.05),Treg明显下降(P<0.05),Th17/Treg明显升高(P<0.05);各药物治疗组第0周Th17明显升高(P<0.05),Treg明显下降(P<0.05),Th17/Treg明显升高(P<0.05);环孢素组第4、6Treg明显升高(P<0.05);全方组、益气方组、化湿方组第2周Treg明显升高(P<0.05)。与模型组比较,环孢素组第4、6周Th17明显下降(P<0.05),第2周Treg明显升高(P<0.05),第2、4、6周Th17/Treg明显下降(P<0.05);全方组,益气方组,活血方组,化湿方组第2、4、6周Th17、Th17/Treg明显下降(P<0.05);益气方组,化湿方组第4、6周Treg明显升高(P<0.05),活血方组第2、4、6周Treg明显升高(P<0.05)。与环孢素组相比,各中药治疗组第6周Treg明显升高(P<0.05)。3.肾脏病理:(1)HE染色:与空白对照组相比,模型组光镜下观察可见肾小球明显肿大,肾小球基底膜弥漫性增厚,毛细血管襻受压,部分肾小管上皮细胞肿胀,各治疗组损伤均较模型组减轻;(2)Ig G免疫荧光:与空白对照组相比,模型组及各治疗组肾小球毛细血管襻及系膜区Ig G荧光沉积,呈弥漫性的散在颗粒状,模型组荧光强度为+++~++++,各治疗组荧光强度为++~+++;(3)电镜:与空白对照组相比,模型组可见上皮下大量电子致密物沉积,足突广泛融合或消失。与模型组相比,各药物干预组的肾小球病变程度均有减轻。足突宽度比较:与空白对照组相比,模型组足突宽度显著增宽(P<0.05),足突融合。与模型组相比,各治疗组足突宽度显著缩小(P<0.05),足突融合减轻。与环孢素组相比,各中药治疗组足突宽度水平无明显差异(P>0.05)。4.免疫组化:与空白对照组比较,模型组大鼠肾组织α-actinin-4蛋白表达水平上调(P<0.05),CD2AP蛋白表达水平下调(P<0.05);全方组、活血方组、化湿方组α-actinin-4蛋白表达水平上调(P<0.05);全方组、益气方组CD2AP蛋白表达水平下调(P<0.05)。与模型组比较,各药物治疗组α-actinin-4蛋白表达水平均下调(P<0.05),CD2AP蛋白表达均上调(P<0.05)。与环孢素组相比,全方组、活血方组、化湿方组α-actinin-4蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。5.RT-PCR:与空白对照组相比,模型组α-actinin-4 m RNA表达水平显著上调(P<0.05),CD2AP m RNA表达水平显著下调(P<0.05);各治疗组未见明显差异(P>0.05)。与模型组相比,环孢素组α-actinin-4 m RNA表达水平显著下调(P<0.05),CD2AP m RNA表达水平显著上调(P<0.05);益气方组α-actinin-4 m RNA表达显著下调(P<0.05),活血方组CD2AP m RNA表达显著上调(P<0.05)。与环孢素组相比,各中药治疗组α-actinin-4和CD2AP m RNA表达水平无明显差异(P>0.05)。6.WB:与空白对照组相比,模型组α-actinin-4蛋白表达水平显著上调(P<0.05),CD2AP蛋白表达水平显著下调(P<0.05);各治疗组α-actinin-4蛋白表达水平显著上调(P<0.05);益气方组CD2AP蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。与模型组相比,环孢素组α-actinin-4蛋白表达水平显著下调(P<0.05),CD2AP蛋白表达水平显著上调(P<0.05);全方组、益气方组和活血方组α-actinin-4蛋白表达水平均显著下调(P<0.05);活血方组CD2AP蛋白表达显著上调(P<0.05)。与环孢素组相比,各中药治疗组α-actinin-4和CD2AP蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)。结论:1.益气活血化湿方及各拆方组通过下调Th17细胞和上调Treg细胞来调节Th17/Treg的平衡,进而达到治疗被动型Heymann肾炎大鼠的作用。2.益气活血化湿方可明显降低PHN模型大鼠尿蛋白水平,减轻肾小球损伤,其机制可能与下调裂孔膜蛋白α-actinin-4表达、上调CD2AP表达有关。且其拆方益气方和活血方分别对α-actinin-4和CD2AP表达具有显著影响。