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衣康酸是一种不饱和二元羧酸,是化工和材料领域的重要原料和添加剂,可作为构造模块应用于塑料、化纤、超吸附剂、乳胶、防垢剂等生产中。在2004年,美国能源部将衣康酸评选为12种最具发展潜力的来源生物质的平台化合物之一。利用土曲霉等真菌微生物转化廉价多糖生成衣康酸,是目前国际上最常用的工业化生产技术。然而,由于土曲霉等真菌自身存在各种问题,例如工业生产菌株改造困难,菌体生长缓慢,蛋白酶系统复杂,发酵过程持续需氧量高等缺点,土曲霉生产衣康酸的产量已经40余年没有提升了。因此,随着基因工程、合成生物学及系统生物学的飞速发展,越来越多的研究者将目光聚焦于其他底盘细胞,将衣康酸合成途径构建在异源细胞中,如酵母细胞、谷氨酸棒状杆菌等,以期提升工业衣康酸的产能。基于此,本论文致力于利用合成生物学策略,在大肠杆菌E.coli中整合产衣康酸多酶级联催化反应,通过多种方式对级联反应多酶进行自组装,并结合CRISPR-Cas9基因组编辑技术进行代谢工程改造,探索并开发高效生产衣康酸的代谢工程菌。本文主要研究内容分为以下几个部分:1、大肠杆菌中衣康酸代谢途径的构建,以及胞内双酶自组装通过基因工程的手段,将土曲霉中合成衣康酸的双酶级联代谢途径(乌头酸酶ACN与乌头酸脱羧酶CAD),共表达到大肠杆菌Rosetta(DE3)中,同时利用相互作用蛋白对PDZ及其配体PDZ ligand(PDZlig),分别修饰ACN和CAD。利用分子筛-HPLC检测两个酶的分子量大小,结果显示ACN酶为单亚基酶,而CAD酶为双亚基酶。比较融合改造酶和原始酶之间的酶活,发现基因融合并不影响酶的空间结构及其功能。通过动态光散射DLS分析胞外组装体的形成,结果显示多酶复合体粒径约30-40 nm,APd与CPl最佳组装比例和组装时间分别为2:1和30 min,同时发现其胞外自组装具有较强的浓度依赖性。与未组装菌uCA相比,双酶自组装菌sPP具有更高的催化效率,在pH为6.5,底物柠檬酸钠浓度为0.5 M的恒pH反应器中催化30 h,生成了 8.7 g/L的衣康酸,是未组装菌uCA的1.7倍,这说明在多酶组装体中,两个酶之间形成相应的底物通道,增加了中间产物的局部浓度,从而提高了级联反应的催化效率。在反应前期sPP的催化效率远高于uCA,但在后期催化过程中,组装的催化效果减弱,这可能是由于酶活损失或产物抑制导致的。2、三酶合成途径多方式自组装及胞内胞外纳米多酶体表征多酶级联催化反应中关键酶酶活对催化效率具有极大的影响,利用密码子优化和替换基因来源的方式,重新构建表达了来自土曲霉的CAD酶,来自谷氨酸棒状杆菌的ACN和GA酶。首先设计了一种线性随机自组装系统L-Assembly(LA),利用相互作用蛋白对PDZ domain/PDZlig分别与GA、ACN和CAD三酶进行融合,形成改造蛋白GPd、APd和CP1;同时利用两对相互作用蛋白对PDZ domain/PDZlig和SH3 domain/SH31ig构建了顺序自组装系统,通过调节蛋白结构域的连接顺序及融合末端,构建了4组顺序自组装方式,通过比较细胞催化效率,发现4种组装方式都有提高衣康酸产量的效果,最终筛选到最优化组装模式API-CS1-GPS,命名为D-Assembly(DA)。通过在胞外以一定比例混合或者在胞内共表达三酶的方式,构建LA和DA的自组装多酶体。利用动态光散射DLS检测自组装多酶体的形成,同时通过扫描电镜和原子力显微镜鉴定,结果显示LA形成的随机自组装多酶体为30-200 nm大小的纳米颗粒结构,而DA形成的顺序自组装多酶体粒径更为均一,大小约为80-120nm大小的纳米颗粒结构,最佳组装比例为亚基摩尔数1:1:1。利用三分子荧光互补实验(TFFC)对胞内自组装动力学进行了表征,结果显示组装在14 h前较慢,这可能是由于蛋白表达过程中浓度较低导致,在14h以后蛋白表达接近尾声,此时胞内自组装快速进行,在20h后完成组装,这说明胞内自组装与蛋白表达同时进行,并且具有较强的浓度依赖性。LA和DA在opMM培养基中发酵100 h,以未组装菌uaCGA为对照,LA、DA的衣康酸产量与uaCGA相比都显著提升,分别达到1.6倍和3.5倍,证明顺序自组装系统DA具有比线性随机自组装系统LA更强的促进催化效率的能力3、基于CRISPR-Cas9技术的代谢工程改造及高产衣康酸自组装工程菌的构建通过CRISPR-Cas9基因组编辑技术对大肠杆菌进行代谢工程改造,通过功能检索和代谢网络分析,最终删除了乙醛酸通路aceA基因、TCA循环异柠檬酸下游基因icd、乙酸副产物通路poxB基因、甲酸副产物通路pflB基因和乳酸副产物通路ldhA基因。在敲除菌中分别整合LA和DA,结果显示顺序自组装优于线性随机自组装,MG1655 DA-A6(删除aceA、icd、poxB、pflB和ldhA基因)最终产生3.06g/L的衣康酸,转化率为0.43 mol/mol葡萄糖,与未组装菌uaCGA相比,DA-A6最终使衣康酸产量提高了612%,同时通过代谢工程改造,使副产物乙酸的量降低了 79%,甲酸和乳酸副产物基本无法被检测到。综上所述,本课题在异源宿主大肠杆菌中通过代谢工程改造、基因优化及多酶自组装等策略,成功得到一株高产衣康酸的工程菌株(目前摇瓶发酵最高水平)。同时,本课题创新性构建的自组装多酶体,不仅实现了三酶在空间上的精确控制,而且可以形成相应的多酶底物通道,因此给其他重要的双酶、三酶及以上的级联催化反应构建多酶组装体带来了新的思路和策略。