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禽流感病毒不仅引起养禽业的巨大经济损失,而且还严重威胁着人类的健康。引起人类流感大流行的多数病毒均发生了禽流感病毒的基因与哺乳动物流感的基因重配,H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在,它是当前流行的主要禽流感亚型之一。因此,H9N2亚型禽流感病毒基因与哺乳动物流感病毒发生基因重配的潜在威胁不容忽视。为了了解禽流感病毒和哺乳动物流感病毒聚合酶蛋白不同组合下对聚合酶活性的影响,本研究构建了H9N2亚型禽流感病毒(A/Chicken/Shanghai/2093/2009毒株,简称A2093)和几种哺乳动物流感病毒的PB1、PB2、PA、NP的真核表达质粒。利用体外流感病毒复制子系统,在293T细胞上测定了聚合酶和NP蛋白不同组合下聚合酶活性。结果显示,哺乳动物流感病毒的聚合酶活性比A2093的聚合酶活性高。当A2093的PB1或NP蛋白分别与哺乳动物流感病毒其他聚合酶蛋白组合时,聚合酶活性保持在较高水平;而PB2或PA与哺乳动物流感病毒其他聚合酶蛋白组合时聚合酶活性显著降低。反之,哺乳动物流感病毒的PB1或NP与H9N2禽流感病毒其他聚合酶蛋白组合时,聚合酶活性保持在较低水平;然而当哺乳动物流感病毒的PB2或PA与H9N2禽流感病毒其他聚合酶蛋白组合时,聚合酶活性显著的提高。聚合酶活性降低可能是导致H9N2亚型禽流感病毒PB2和PA基因难以与哺乳动物流感病毒发生重配的主要原因。为了进一步了解聚合酶基因重配对病毒复制的影响,利用A2093和WSN的反向遗传操作系统,将A2093的HA、NA和一个(或两个)聚合酶基因分别替换WSN的相应基因,发现含有H9N2亚型禽流感病毒的PB1或NP基因的重配病毒在MDCK上可以很好的复制,而含有H9N2亚型禽流感病毒的PA或PB2基因的重配病毒在MDCK上的复制水平都较低。动物实验表明,鼻腔接种感染小鼠后,虽然重配病毒在小鼠肺脏中的滴度相似,但含有H9N2亚型禽流感病毒的PB1基因的重配病毒可以导致小鼠的体重明显下降,而PA基因的重配病毒感染小鼠体重下降不明显。这些结果表明含有H9N2亚型禽流感病毒PA基因的哺乳动物流感病毒在细胞上复制能力降低,同时对小鼠致病力也明显降低。为探索A2093病毒PA基因导致WSN病毒在细胞上复制能力降低的机制,将不同组合的聚合酶蛋白表达质粒共转染293T细胞,通过western-bolt方法发现当H9N2亚型禽流感病毒的PA蛋白存在时,其他聚合酶蛋白的表达量会明显降低。将禽流感病毒(A2093、441、D6、4664)与哺乳动物流感病毒(WSN、CIV、SIV、pdm09)的PA表达质粒分别与eGFP表达质粒共转染293T细胞后,上述流感病毒的PA都可以抑制eGFP基因的表达,禽流感病毒的PA抑制eGFP的表达更加显著,而哺乳动物流感病毒的PA蛋白对eGFP基因表达的抑制较弱。为进一步探索PA抑制蛋白表达的机理,通过点突变去除掉PA基因移码编码PA-X蛋白的功能后,发现PA基因抑制基因表达的能力随之丧失,表明PA蛋白对eGFP基因表达的抑制能力是由PA-X引起的,禽流感病毒A2093 PA-X的活性强于WSN。进一步通过荧光定量方法检测mRNA的含量;也发现PA-X抑制基因表达主要是通过降低mRNA水平实现的。利用反向遗传操作技术,拯救获得了PA-X缺失的H9N2亚型禽流感病毒与WSN病毒,在MDCK和LMH细胞上检测病毒复制,发现当PA-X缺失后A2093和WSN病毒在上述细胞的复制水平都会降低,表明PAX有利于病毒复制;进一步对缺失PA-X的PA进行基因替换和病毒拯救,发现在WSN病毒背景下,含有A2093病毒缺失PA-X的PA基因的病毒比含有正常A2093病毒PA基因的病毒更容易在MDCK和LMH细胞上复制,推测由于H9N2禽流感病毒PA基因编码的PA-X蛋白过度降解宿主mRNA,限制病毒在宿主细胞上的复制,从而抑制了禽流感病毒PA基因重配到哺乳动物流感病毒。本研究发现了不同种属来源的流感病毒PA基因在病毒基因重配中的限制作用,并部分阐明了相关分子机理,为流感病毒防控提了供理论依据。