背景原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)起病隐匿,进展迅速,病死率仅次于肺癌,位居第二位,严重危害人类健康。中医药是原发性肝癌患者重要的辅助治疗手段,可以控制肿瘤患者的病情进展,阻遏肿瘤转移复发,延长患者生存时间。本研究是北京市科技计划十病十药研发项目:清肝化瘀颗粒治疗原发性肝癌的主要药效学与安全性评价(Z171100001717008)。清肝化瘀方是姚树坤教授集多年经验形成的治疗肝癌的有效经验方。本课题组前期动物实验和细胞实验明确了清肝化瘀方的主要有效组分氧化苦参碱类等,在各类肿瘤中均具有具有明确的抗肿瘤、抑制细胞增殖的作用。目的本研究将为清肝化瘀药效学研究提供一个稳定的、符合实验要求的肝癌模型;并进行急性毒性试验,为临床用药的安全性提供参考。方法实验一:实验用ICR小鼠80只,体重18～21g,随机分为对照组和清肝化瘀颗粒26.8、35.8、48.3、64.4、85.9、116.3、153.8.g生药/kg 7个剂量组,每组各10只。禁食15 h后灌胃给药1次,给药体积40ml/kg体重,对照组给予同体积动物饮用水。给药后观察毒性反应,记录不良反应。第14天观察期结束时,对存活动物剖检,观察各脏器改变。实验二:SPF级健康雄性SD大鼠72只,体重220±20g,约6周龄,适应性饲养一周后,分为空白组(n=12)、造模一组(n=30)、造模二组(n=30),给药组(造模一组和造模二组)均采用腹腔注射DEN,50mg/kg;造模一组每周给药1次,造模二组每周给药2次。观察大鼠的的一般状况、毛色、活动、步态、神态、大便、尿液等;记录体重和摄食量变化;记录每组大鼠的存活情况,计算每组大鼠自然死亡率;每组于W3、W5、W6、W9,随机选取3只大鼠进行观察;将大鼠进行解剖,重点观察肝组织的颜色,有无充血、水肿、硬化、癌结节;病理光学显微镜下观察各组是否病变以及病变程度,分析大鼠肝组织病变是否与给药频次有关。结果:1清肝化疲急性毒性试验1.1小鼠死亡率和不良反应观察清肝化瘀颗粒以26.8、35.8、48.3、64.4、85.9、116.3、153.8g生药/kg,40ml/kg给药体积,一次性经口给予小鼠,可观察到的主要毒性反应为急性死亡且动物死亡时间发生在药后1-24h内;上述剂量给药当日的动物死亡率分别为0%、0%、0%、20%、40%、100%和60%;药后24h内各剂量组的动物死亡率分别为0%、0%、0%、20%、100%、100%和100%。本品临床拟用最大剂量为0.67g生药/kg。清肝化瘀颗粒一次性经口给予小鼠后,64.4g生药/kg剂量组有2只、85.9、116.3、153.8g生药/kg剂量组10只均急性死亡。Bliss法计算半数致死量(LD50)为69.94g生药/kg(相当于临床剂量的104倍),最大无致死剂量为48.3g生药/kg,最大无毒反应剂量为26.8g生药/kg。除急性死亡外,不良反应主要为腹泻、静卧、步态不稳、翻正反射消失伴肢体僵直。1.2对小鼠体重和摄食量的影响与对照组相比,给药后14天内,清肝化瘀颗粒雄性大鼠153.8g生药/kg剂量组在药后D1-14体重均较对照组偏低,其中Dl体重较对照组明显降低(P<0.01),其余各时间点未见明显的统计学差异;雄性大鼠的其它剂量组和雌性大鼠各剂量组在各时间点与对照组体重基本相当。与对照组比较,清肝化瘀颗粒雄性大鼠153.8g生药/kg剂量组于给药后D1摄食量较对照组降幅明显,约为对照组的52%,D2后摄食量已与对照组基本接近;雄性大鼠动物的其它剂量组和雌性大鼠动物各剂量组在各时间点与对照组摄食量基本相当。1.3大体解剖观察14天观察期结束,解剖后肉眼观察,动物胸、腹腔未见渗液、出血和粘连,脏器未见充血、瘀血、出血、渗液、粘连、糜烂、溃疡等肉眼可见的病变。2大鼠原发性肝癌模型的改良2.1对大鼠自然死亡率和不良反应的观察正常对照组(1～4笼)从观察开始至结束自然死亡率皆为0%,存活率为100%;A组从W17开始死亡到W22观察结束,除解剖的大鼠,自然死亡率分别为22.22%、38.89%、44.44%、44.44%、50.00%、100.00%;B组毒性反应明显,从W5开始出现死亡,在W5然死亡4只、W6自然死亡6只、W7自然死亡4只、W8自然死亡1只,W9自然死亡3只,截止第9周末B组全部死亡,自然死亡率分别为:22.22%、55.56%、77.78%、83.33%、100.00%。Kaplan-Meier生存分析结果显示,A组和B组生存率有明显差异,经Log-Rank检验,两组总生存期差异有统计学意义(P<0.01)。除死亡以外,各组的一般状态观察,空白组尿色、采食、饮水、体毛等各项指标无明显异常;A组和B组肉眼可见的不良反应主要表现为毛发竖立、尿色澄黄、鼻部出血;出现症状后皆未见恢复;部分大鼠存在合并症状;A组毛发竖立、尿色澄黄、鼻部出血的发生率为22.22%、11.11%、11.11%;B组毛发竖立、尿色澄黄、鼻部出血的发生率为27.78%、88.33%、、66.67%。2.2对大鼠体重和摄食量的影响与对照组相比,给药后B组体重于第1～3周呈缓慢的增长趋势,从第4～9周呈明显下降的趋势。观察22周结束,空白组与A组的增长趋势基本接近,未见持续性下降的情况。与对照组比较,给药后B组摄食量呈明显减少趋势,空白组与A组的摄食量增长趋势基本接近。2.3对大鼠的毒性作用随着给药的频次增加,大鼠病情逐渐加重。B组第5周时大鼠开始出现死亡,癌结节形成;肝组织8周内从鲜红色变为深红色,直至变为深紫色;9周时产生大量腹水,自然死亡率达到100%。直至B组大鼠死亡,观察各组大鼠肝组织的病理切片(HE染色),镜下观察:空白组肝小叶结构清晰,肝细胞以中央静脉为中心呈放射状分布,呈条索状排列,细胞大小一致,胞质丰富,核膜、核仁清晰明显,未见变性与坏死,未见炎症细胞浸润。第5周,B组镜下观察大鼠肝组织假小叶形成,肝细胞排列紊乱呈灶状、巢状以及梁状排列,胞核大,部分肝细胞呈双核或多核。肝小叶内部分区可见肝炎肝细胞空泡变性。第6周,B组可见肝小叶结构破坏,变成大小不等、形状不规则的假小叶。肝细胞变性、坏死,排列紊乱,细胞呈双核或者多核,见瘤灶内出血、坏死,炎症细胞浸润以及细胞核分裂。第9周,B组镜下观察:可见肝硬化,肝小叶结构破坏,变成大小不等、形状不规则的假小叶。肝细胞变性、坏死,排列紊乱,细胞呈双核或者多核,细胞异型性明显,核分裂像多见,可见病理性核分裂像。B组在第6周而A组在17周镜下观察才可见:肝硬化肝小叶结构破坏,变成大小不等、形状、以及不规则的假小叶。肝细胞排列紊乱,存在变性、坏死,细胞呈双核或者多核,见瘤灶内出血、坏死,炎症细胞浸润以及细胞核分裂。结论1.清肝化疲颗粒给予小鼠26.8g生药/kg(相当于临床剂量的40倍)时无毒性反应;药量达到临床剂量的104倍,即69.94g生药/kg时,达到小鼠半数致死量。提示清肝化瘀颗粒临床拟用剂量(0.67g生药/kg)安全。2.观察22周结束,随给药频次的增加,B组肝组织病变程度加重,大鼠死亡率增加,生存期明显减少,一周一次给予大鼠DEN的造模方法,17周出现自然死亡,因生存期长,与人类肝癌自然发病的特点相似,更适用于抗原发性肝癌的新药研发。