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目的 2,3-吲哚醌(indol2,3-dione,isatin,MW147)又名靛红,是存在于龙虾并维持其生存所必需的一种天然活性物质,也存在于经典抗癌中药青黛中,又是我国独创Ⅰ类抗癌新药靛玉红的先导化合物。本课题组已经通过小鼠移植瘤模型证明2,3-吲哚醌在体内可以抑制多种肿瘤,并且抑瘤作用呈现量效关系。本文主要针对2,3-吲哚醌在体外对人神经母瘤细胞(SHSY-5Y)的抗肿瘤作用进行研究,并探讨其作用机制,以期开发2,3-吲哚醌在抗癌方面的药用价值。 方法 ①细胞凋亡检测—核染色(Hoechst33258染色):人神经母瘤细胞(SHSY-5Y)分为2,3-吲哚醌加药组(50,100,200μM组)和阴性对照组(二甲亚砜),与2,3-吲哚醌作用80小时后,Hoechst33258染色,荧光显微镜下观察细胞核形态学变化。 ②细胞增殖活性测定—MTT比色法:人神经母瘤细胞(SHSY-5Y)分为2,3-吲哚醌加药组(50,100,200,300μM组)和二甲亚砜阴性对照组。2,3-吲哚醌作用48小时后,MTT比色法测定各组细胞在490nm的吸光度值(O.D.),分析并计算不同浓度药物组对细胞增殖的抑制率。 ③ELISA法测定血管内皮细胞生长因子(VEGF)分泌:神经母瘤细胞(SHSY-5Y)分为2,3-吲哚醌加药组(50,100,200μM组)和二甲亚砜阴性对照组。2,3-吲哚醌作用24小时后,离心取细胞上清液,ELISA试剂盒测定上清液中VEGF的含量,并收集各孔细胞进行细胞计数。VEGF的自分泌情况表达为pg protein/ml/10~5cells/24h。 ④Western-blot测定磷酸化的有丝分裂原激活的蛋白激酶蛋白(pp42/pp44)的相对表达情况:人神经母瘤细胞(SHSY-5Y)分为2,3-吲哚醌加药组(50,100,200μM组)和二甲亚砜阴性对照组,经不同浓度药物处理后,提取蛋白(Lowery法蛋白定量),10%SDS-PAGE电泳,然后电转移至PVDF膜上。封闭膜后,分别与一抗、二抗和化学发光剂作用,与X光胶片成像。观察磷酸化的有丝分裂原激活的蛋白激酶(pp42/pp44)的相对表达情况。 结果 ①2,3-吲哚醌药物组的细胞核出现典型的凋亡形态学改变:细胞核染色质高度聚集,并裂解为碎块,产生了凋亡小体。而对照组的细胞没有出现这些细胞核染色质的形态学改变。 ②MTT法所得吸光度(O.D.值)结果显示各浓度2,3-吲哚醌加药组O.D.值均明显低于阴性对照组(P<0.01),并且高浓度2,3-吲哚醌(300μM组)对人神经母瘤细