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[研究背景与目的]酒精性肝病长期以来威胁着人类的健康,初期典型的病理特征是肝细胞脂肪变性,随着疾病的发展,肝细胞损伤继而可能发生坏死性凋亡,进一步诱发炎症反应,该阶段称为酒精性肝炎。随后,肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)在炎性因子刺激下活化,其活化并分泌大量细胞外基质成分是肝纤维化病理进程中的核心事件,该阶段是肝纤维化阶段。近年来研究发现核因子 E2 相关因子 2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)与酒精性肝病的发生发展密切相关,可能是疾病演进的核心分子。从中药活性成分中挖掘治疗酒精性肝病的候选药物已成为当前国内外研究的热点。本课题组长期致力于研究天然活性分子姜黄素在抗肝纤维化中的作用,从体内外两个层面初步明确了姜黄素的抗肝纤维化药理活性,并进一步揭示了抑制HSC活化是姜黄素发挥药效的重要途径。此外,近年来研究发现姜黄素在酒精性肝损伤方面也表现出较强的治疗效应。在此基础上,本论文提出姜黄素通过激活Nrf2抑制酒精诱导的肝细胞脂肪变性从而改善脂肪肝,并通过抑制坏死性凋亡改善酒精性肝炎,进而抑制HSC活化发挥抗酒精性肝纤维化作用的科学假说,并对此进行实验研究。[研究内容与结果]本研究首先利用天狼星红染色与组织免疫荧光检测临床酒精性肝纤维化患者肝脏中Nrf2与醌氧化还原酶(NAD(P)H:quinoneoxidoreductase1,NQO1)表达,发现肝细胞与HSC内Nrf2表达及活性随着肝纤维化程度的加重而降低;建立酒精诱导的大鼠酒精性肝病模型并给予姜黄素治疗,发现姜黄素能显著改善酒精诱导的肝脏损伤、炎症反应以及脂肪变性,同时明显促进肝脏中Nrf2的表达和活性。体外实验发现,姜黄素能显著削弱乙醇诱导的人肝细胞系L02的损伤和脂肪变性。同时,姜黄素激活肝细胞内Nrf2与法尼酯衍生物 X 受体(farnesoid X receptor,FXR)表达。采用 Nrf2 过表达质粒、Nrf2 siRNA、GW4064和Z-Guggulsterone探究Nrf2与FXR在姜黄素的肝细胞保护作用中的角色。研究发现Nrf2过表达质粒与GW4064可模拟并增强姜黄素抑制肝细胞脂肪变性的作用,而Nrf2 siRNA与Z-Guggulsterone则削弱姜黄素的作用;Nrf2过表达质粒进一步促进姜黄素对FXR的激活作用,而Nrf2 siRNA作用相反。采用尾静脉注射Nrf2短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒建立Nrf2基因敲减小鼠,并进一步建立酒精性肝病模型,研究发现Nrf2基因敲减在一定程度上可加重酒精诱导的肝脏损伤、炎症反应以及脂肪变性。建立酒精诱导的小鼠酒精性肝病模型并给予姜黄素治疗,研究发现姜黄素能剂量依赖性地抑制酒精诱导的肝组织中坏死性凋亡关键基因的表达。建立Nrf2基因敲减小鼠酒精性肝病模型并给予姜黄素治疗,研究发现姜黄素能显著削弱酒精诱导的野生小鼠的肝细胞坏死性凋亡,而姜黄素在Nrf2基因敲减小鼠中无明显改善作用。酒精处理条件下,Nrf2基因敲减小鼠肝组织中p53基因表达强烈,并且Nrf2低表达显著削弱姜黄素对p53基因的抑制作用。体外实验结果表明Nrf2 siRNA同样可削弱姜黄素对肝细胞内p53基因表达的抑制作用;Nrf2 siRNA尽管显著削弱姜黄素对坏死性凋亡关键基因表达的抑制作用,p53 siRNA可抵抗Nrf2 siRNA的作用,恢复姜黄素对坏死性凋亡关键基因的抑制作用。HSC转染Nrf2过表达质粒或Nrf2 siRNA质粒,检测HSC脂肪细胞表型的变化。研究发现Nrf2过表达质粒促进HSC内脂质生成并调控脂质代谢相关基因表达,同时抑制HSC活化标志基因的表达,Nrf2siRNA呈现相反的作用。建立四氯化碳(carbontetrachloride,CC14)诱导的Nrf2基因敲减小鼠肝纤维化模型,研究发现Nrf2基因敲减在一定程度上加重CC14诱导的肝脏损伤、炎症反应以及肝纤维化症状,促进HSC活化标志基因的表达。酪氨酸激酶2/信号转导及转录激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)信号途径抑制剂AG490和Stattic均能明显恢复活化HSC的脂肪细胞表型。Nrf2过表达质粒能显著抑制JAK2/STAT3信号通路以及细胞因子信号传导抑制蛋白-3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的表达。姜黄素能促进活化HSC脂肪细胞表型的恢复,并增强HSC内Nrf2转录活性。体外实验进一步揭示Nrf2过表达质粒可增强姜黄素对HSC脂肪细胞表型恢复的作用,而Nrf2 siRNA可拮抗姜黄素的作用。姜黄素对CC14诱导的肝纤维化的改善作用在Nrf2基因敲减小鼠上收效甚微。乙醇刺激的肝细胞培养液可促进HSC活化,而高迁移率族蛋白 1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)siRNA 转染肝细胞后,其乙醇刺激后的培养液对HSC活化的诱导作用减弱。[结论]综上结果表明姜黄素通过激活肝细胞内Nrf2改善酒精诱导的肝细胞脂肪变性以及肝细胞坏死性凋亡;姜黄素通过激活HSC内Nrf2恢复活化HSC的脂肪细胞表型并抑制其活化;姜黄素通过抑制酒精诱导的坏死性凋亡的肝细胞释放HMGB1阻断其对HSC活化的诱导作用;姜黄素抑制酒精性脂肪肝-酒精性肝炎-肝纤维化的疾病演进。本论文研究确证了Nrf2在姜黄素改善酒精性肝病中的重要作用,系统揭示其中的调控机制,为将姜黄素开发为临床酒精性肝病治疗药物提供有力证据。