论文部分内容阅读
磷酸酶Wip1（野生型p53诱导的磷酸酶1）最初是作为p53的靶基因而被研究，属于PP2C（protein serine/threonine phosphatase2C，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C）家族，且高表达在多种癌症细胞中，例如乳腺癌及卵巢癌等。但Wip1在免疫细胞和免疫系统中功能还是未知的。本实验室有关Wip1的前期研究结果表明，Wip1负向调控中性粒细胞的迁移及炎性反应且正向调控B细胞的发育分化，尤其对于pre-B的发育来讲尤其重要。本博士论文的课题主要研究磷酸酶Wip1对CD4+辅助性T细胞Th9发育分化的调控及磷酸酶Wip1对OVA诱导的过敏性气道炎症的影响。 过敏性哮喘的发病率和死亡率在全球正逐步增加，尤其是在非工业化国家中，其特征是涉及多种炎性反应且肺部组织发生病变重塑，对病人是很重的疾病负担。在最新的研究报道中，很多过敏性哮喘病人肺部中IL-9表达水平较高，IL-9在过敏性哮喘中的作用目前已被确认。对于能够大量分泌细胞因子IL-9的Th9细胞来讲，它们由CD4+na(i)ve T细胞在微环境中在细胞因子IL-4和TGF-β的刺激下发育分化而来。 从Wip1敲除（Wip1KO）小鼠脾脏及淋巴结中分离CD4+na(i)ve T细胞并进行向不同CD4+Th亚群发育分化的诱导。实验结果显示，Wip1缺失的CD4+na(i)ve T细胞在Th9的体外诱导体系中，向Th9发育分化受损且IL-9表达降低。之后的分子信号通路研究结果表明，Wip1KO CD4+na(i)ve T细胞在Th9的诱导体系下，JNK-c-Jun分子信号的表达水平明显高于WT CD4+T细胞。且JNK抑制剂SP600125能够显著降低Wip1KO Th9细胞中JNK及c-Jun的活性，并回复Wip1KO CD4+na(i)ve T细胞向Th9分化的缺陷。之后染色质免疫共沉淀的实验，进一步揭示了Wip1KO Th9细胞中活性增强的c-Jun能与Il-9启动子结合。此外，在双荧光素酶报告实验中，过表达的c-Jun和c-Fos能够明显降低Il-9启动子-荧光素酶的表达，AP-Ⅰ（c-Jun和c-Fos形成）与Il-9启动子的-385位的结合对于JNK抑制Il-9表达是必需的。CD4+T细胞中Wip1被敲除或者活性被抑制后，会增强JNK-c-Jun/c-Fos信号活性，对IL-9的抑制作用增强。 有相关研究报道，Th9细胞能够参与调控不同的免疫应答反应，尤其是过敏性哮喘。为了研究Wip1是否参与调控过敏性气道炎症，我们对WT及Wip1KO小鼠进行OVA致敏及OVA雾化诱导刺激，实验结果显示Wip1KO小鼠对于过敏性气道炎症具有一定的抵抗力。磷酸酶Wip1KO小鼠的病理情况明显轻于野生型WT小鼠。我们用Wip1抑制剂CCT007093进一步证实了Wip1在过敏性气道炎症中的作用。 目前因为Wip1抑制剂能够抑制肿瘤细胞的增殖而被主要应用于肿瘤治疗中。本课题的研究结果表明，Wip1是一个很有潜质的临床药物靶标，可以用于研发治疗过敏性气道炎症，而不仅在临床上应用于抑制肿瘤细胞的增殖。 此外，本文还研究了去乙酰化酶Sirt6在T细胞中的功能。细胞中的遗传因素和表观遗传因素都是免疫系统的重要调控因子。近些年来，对去乙酰化酶家族例如HDAC、Sirt家族蛋白，在免疫应答中的作用研究越来越多。 为了验证Sirt6是否参与调控CD4+na(i)ve T细胞在体外向不同Th细胞亚群分化发育，我们构建了T细胞特异性敲除Sirt6的Lck-Cre+-Sirt6f/f小鼠。从WT及Lck-Cre+-Sirt6f/f小鼠分离CD4+na(i)ve T细胞并进行向不同CD4+Th亚群发育分化的诱导。实验结果表明，T细胞特异性敲除Sirt6后的CD4+na(i)ve T细胞向Th1亚群的发育分化比例降低，缺失Sirt6的Th1细胞表达较低水平的细胞因子IFN-γ及转录因子T-bet，且与T细胞的活化增殖水平无关。 去乙酰化酶Sirt6调控的分子信号通路尚不明确，但蛋白免疫印迹实验表明，Lck-Cre+-Sirt6f/fTh1细胞中NF-κB p65表达明显低于WT Th1细胞。去乙酰化酶Sirt6是否是通过调控NF-κB p65信号通路调控Th1条件下IFN-γ的表达仍需进一步的验证。