ZmGRF10基因功能的遗传转化验证与育种新材料创制

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植物生长调节因子基因[growth-regulating factor (GRF)]是植物中特有的一类转录因子基因家族。在拟南芥和水稻中的研究发现,部分GRF家族基因编码的蛋白具有正向调控茎和叶生长发育的生物学功能,而最近的研究结果表明AtGRF基因则具有抑制与拟南芥渗透压相关基因表达的负向调控作用。据此可以推测,不同的GRF基因可能参与植物不同的生长发育调控和代谢途径,具有不同的生物学调控功能。本实验室在前期的研究中从玉米中克隆了GRF家族的14个基因,通过组织表达特异性表达研究发现,GRF1基因在玉米的幼嫩的茎和叶中超高表达;进一步转化拟南芥发现,带有玉米GRF10基因的转基因植株的叶片生长受到抑制。在如上研究的基础上,本论文进一步上述基因直接转化玉米,重点研究ZmGRF1基因的在玉米中的表达特性及其生物学功能。首先将玉米3RF1基因通过农杆菌侵染转化玉米HiII幼胚,获得了三个转化事件,命名为5-3、5-4和15-5,利用骨干自交系郑58做轮回亲本连续回交7代,得到了10个转基因近等基因系WL-1~WL~10。通过大田试验,连续3代对转基因植株的田间性状进行调查、统计分析及转基因表达水平的分析,试图揭示玉米(GRF10基因的表型效应,同时获得了遗传性状稳定、具有生产应用潜力的转3RF10基因的育种新材料。另外,通过全基因组RNA-seq测序分析,在转基因近等基因系上得到了250个差异表达的基因,对这些基因进行了GO富集及KEGG富集分析,为揭示GRF转录因子家族基因参与的代谢途径及调控机制提供线索。主要研究结果如下:1) ZmGRF10基因相对于ZmGRF基因在玉米的茎和幼嫩叶中表达量具有数十倍的优势,在整个叶片的表达也不完全一样,在细胞分裂比较旺盛的部位表达量较低,而在相对发育成熟的叶尖部位表达量较高。2)通过酵母双杂交实验及GST-pull down实验验证了ZmGRF1基因编码了一个失去转录激活活性的转录因子,并与玉米中GIF1和GIF2蛋白形成复合蛋白体。3)构建植物过表达载体,将ZmGR1基因转化拟南芥和玉米,发现在拟南芥中,ZmGRF1基因的过量表达会抑制拟南芥叶片的生长,在玉米中具有相似的表型效应,通过对转基因植株叶片进行扫描电镜观察,发现ZmGRF10是通过抑制细胞的增殖进而负向调控玉米叶片和茎的生长发育,但对玉米果穗性状未产生明显影响,而且不论在亲本背景还是杂交种背景下表现一致。4)对转基因植株与非转基因近等基因姊妹系进行]RNA-seq测序分析显示,在转基因姊妹系上发现了174个上调和76个下调表达的基因,对这些基因进行GO富集分析发现,这些基因分别参与了多个生物学通路,如碳水化合物代谢、酶催化反应等,其中部分差异表达基因已经被证明是植物生长和发育中有重要作用调控因子。上述研究结果表明,ZmGRF1在玉米的生长过程中有明显的表型效应,并可能对一系列重要基因的表达起调控作用;本论文创制的转基因新材料在现代玉米高密育种中可能具有一定的利用价值。
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