选题依据:抑郁症（depression）是一种常见的精神病理状态或情绪障碍综合征,对人类生活的严重危害性与现有抗抑郁药物的力不从心,迫使我们从新的视角认识抑郁症的病理机制。而合理的抑郁症模型是研究抑郁症病机的关键,体外细胞模型因其稳定、结果可靠等优点,被广泛应用于抑郁症机制研究,皮质酮（CORT）致PC12细胞损伤是基于抑郁症下丘脑-垂体-肾上腺轴活化理论所建立的体外抑郁模型,该模型具有易获得、对外界应激敏感等优点,能够较为真实地反映了机体神经系统在外界刺激下的状态,故本研究拟采用皮质酮致PC12细胞损伤模型作为研究抑郁症的体外细胞模型。本课题组前期通过代谢组学研究发现,抑郁症和阿霉素肾病的发病机制均与能量代谢紊乱有关,那么抑郁症导致能量代谢紊乱的具体代谢途径及其特异性是什么?代谢组学技术并不能解决上述两个问题,因为代谢组学能够对微妙的代谢变化作出系统性反应,识别潜在的生物标志物,但代谢组学检测的是生物学反应末端化合物在体内复杂代谢后的总和,而机体的能量代谢涉及的每一类物质有多条代谢途径,代谢组学的结果无法精确到具体的代谢通路上。稳定同位素示踪技术可对所研究代谢通路中的前体物质进行针对性的原子标记,采用质谱技术分析,通过示踪原子追踪所标记的化合物在体内的来龙去脉活动规律,从中间产物的同位素峰分布来判断具体的代谢通路,对体内微量的化合物活动规律进行准确的追踪,恰能弥补代谢组学的缺陷,特别适于代谢通路和代谢机制研究。本研究以皮质酮致PC12细胞损伤模型为研究对象,阿霉素（ADR）致肾小球足细胞损伤模型为比较对象,¹³C₆-葡萄糖为示踪剂,采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测技术优化稳定同位素孵育细胞时间、浓度及样品前处理方法,同时结合代谢组学技术,研究抑郁症细胞模型在能量代谢网络中的代谢特征,明确其能量代谢紊乱的特异性机制。目的:1.基于高分辨LC-MS分析技术对细胞样品前处理方法进行考察,在两种体外细胞模型复制成功的基础上,运用LC-MS代谢组学技术对两种体外细胞模型进行研究,初步探究能量代谢网络中葡萄糖代谢通路上的差异代谢物,找到与正常组比较存在的能量代谢紊乱机制,明确每个模型的能量代谢通路紊乱状况。2.运用LC-MS分析技术,以总离子流图和关键中间代谢物的同分异构体信号丰度占比为参考指标,明确¹³C₆-葡萄糖稳定同位素示踪剂引入细胞最佳浓度和孵育细胞时间。3.在代谢组学研究结果的基础上,以能量代谢前体物质¹³C₆-葡萄糖为稳定同位素示踪剂,对同位素在两种体外细胞模型内的代谢途径进行分析,发现抑郁症导致能量代谢紊乱的特异性代谢途径,阐释抑郁症的能量代谢紊乱机制,为基于能量代谢调节作用的抗抑郁药物研发提供参考依据。方法:1.基于LC-MS分析方法对PC12细胞的5种样品前处理方法进行考察,5种前处理方法分别为:33%甲醇淬灭-超声破碎细胞-70%乙腈复溶、33%甲醇淬灭-超声+反复冻融破碎细胞-70%乙腈复溶、33%甲醇淬灭-超声破碎细胞-70%甲醇复溶、80%乙腈淬灭-超声破碎细胞-70%乙腈复溶、80%乙腈淬灭-超声破碎细胞-70%甲醇复溶。同时在两种体外细胞模型复制成功的基础上,采用代谢组学技术,对两种细胞模型进行代谢研究,找到差异代谢物,发现关键代谢通路,为用示踪技术进一步明确与能量代谢有关的作用机制提供基础。2.在细胞处于指数增长期进行¹³C₆-葡萄糖的引入,根据总离子流图和关键中间代谢物的同分异构体信号丰度占比,对稳定同位素浓度（5、10、15、20、25 mM）和示踪时间（12、24、36、48 h）进行研究。3.紊乱的能量代谢通路发现与明确特异性:以¹³C₆-葡萄糖作为稳定同位素示踪剂,采用LC-MS和Compound Discoverer 3.0软件中的同位素数据处理模块“the workflow Stable Isotope Labeling with Metabolika Pathways and ID”,明确被标记的前体物质在能量代谢网络中的代谢过程。结果:1.通过对5种前处理方法进行摸索,以与能量代谢通路上部分中间代谢物（富马酸、乳酸、苹果酸、丙酮酸、葡萄糖）的峰面积为指标结合LC-MS总离子流图,确定了最优前处理条件:首先用33%甲醇淬灭,再用超声破碎细胞（超声5 s,停顿9 s,连续15 min）,最后70%乙腈复溶。通过代谢组学发现了皮质酮致PC12细胞损伤模型的23种差异代谢物,涉及14条代谢通路,阿霉素致肾小球足细胞损伤模型的21种差异代谢物,涉及15条代谢通路,其中两种体外细胞模型共有的差异代谢物有8种,分别为葡萄糖、丙酮酸、乳酸、谷氨酸、亮氨酸、牛磺酸、4-羟基丁酸、丙氨酸,共有差异代谢通路9条,分别为丙酮酸代谢、三羧酸循环（TCA循环）、糖酵解/糖异生、谷氨酰胺和谷氨酸代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨酰基-tRNA的生物合成、牛磺酸代谢、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸的代谢、精氨酸生物合成。多种差异代谢物与多条代谢通路分布在能量代谢网络中。2.根据总离子流图和关键中间代谢物的同分异构体信号丰度占比,对稳定同位素浓度和示踪时间进行考察,明确了稳定同位素最佳浓度为10 mM和最佳孵育细胞时间为24 h。3.通过稳定同位素示踪研究,发现了两种体外细胞模型在能量代谢网络中存在一些代谢差异,如在皮质酮致PC12细胞损伤模型中葡萄糖M+3和苹果酸M+3信号丰度占比显著高于空白组,说明糖异生途径被激活,且是通过增加丙酮酸转化为苹果酸的通量来激活,而在阿霉素致肾小球足细胞损伤模型内发现丙酮酸M+3和苹果酸M+3信号丰度占比显著低于空白组,说明糖异生途径被抑制,且是通过降低丙酮酸转化为苹果酸的通量来抑制。此外,皮质酮致PC12细胞损伤模型中苹果酸、富马酸和琥珀酸的M+4信号丰度占比显著低于空白组,阿霉素致肾小球足细胞损伤模型中富马酸的M+2和M+4以及琥珀酸的M+2信号丰度占比显著高于空白组,而模型组苹果酸M+4信号丰度占比显著低于空白组,说明两种体外细胞模型的三羧酸循环代谢均被抑制,阿霉素致肾小球足细胞损伤模型三羧酸循环紊乱的关键节点可能发生在富马酸向苹果酸转化的代谢途径上,而皮质酮致PC12细胞损伤模型导致其三羧酸循环紊乱的节点可能发生在富马酸的上游通路。4.通过稳定同位素示踪技术,还发现了两种细胞的代谢具有一些相似之处,例如两种体外细胞模型中腺嘌呤碱基合成减少,腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水平降低;通过观察尿嘧啶、鸟嘌呤等核苷酸被稳定同位素标记的程度,发现两种体外细胞模型的腺苷酸代谢途径均被抑制,此现象与细胞活力和乳酸脱氢酶释放率测试结果一致。结论:本研究首先通过代谢组学探究了两种体外细胞模型的能量代谢紊乱途径,然后通过稳定同位素示踪技术研究了皮质酮致PC12细胞损伤模型导致能量代谢紊乱的特异性机制:模型组中三羧酸循环、糖异生、糖酵解、腺嘌呤核苷三磷酸生成途径发生了紊乱,如三羧酸循环、糖酵解、糖酵解被抑制,糖异生途径通过增加丙酮酸转化为苹果酸的通量来激活。