研究背景我国食管癌以食管鳞状细胞癌（esophageal squamos cell carcinoma,ESCC）为最常见的病理类型。化疗抵抗引起食管鳞癌的复发和转移仍是主要临床问题。机体对化疗的反应会加强或者削弱肿瘤治疗的效果。巨噬细胞和T细胞等免疫细胞在肿瘤微环境中的浸润,也会激活机体不同的肿瘤特异的免疫反应。机体免疫缺陷可能是导致化疗抵抗的一个重要原因。因此,探究机体先天性和适应性免疫对食管鳞癌的进展和化学治疗的影响,具有重要临床意义。NLRP3炎症小体（inflammasome）是机体参与先天免疫防御过程的一种主要复合物。它是由NLRP3蛋白感受器、凋亡相关的斑点样蛋白（ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶前体（procaspase-1）组成的蛋白质复合物。其功能使procaspase-1自我切割成有活性caspase-1,将促炎细胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18裂解成有活性的白介素IL-1β和IL-18,发挥相应效应。NLRP3炎症小体在乳腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤和头颈鳞状细胞癌等多种实体肿瘤异常激活发挥促癌作用。但NLRP3炎症小体在结肠癌中却阻止结肠炎恶变,起到抑癌作用。然而对食管癌仅有文献报道:脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）可激活巴雷特食管上NLRP3炎症小体,促进巴雷特食管发生癌变,但NLRP3炎症小体对食管鳞癌的具体作用尚不清楚。因此,值得进一步探究。研究也发现:某些化疗药物可激活肿瘤细胞中NLRP3炎症小体,并募集免疫细胞浸润在肿瘤微环境中,引起机体肿瘤免疫的改变影响治疗效果。CD47是一种细胞表面蛋白,是肿瘤先天免疫逃避的主要机制。CD47可与表达在巨噬细胞上的信号调节蛋白α（signal regulatory proteinα,SIRPα）相互作用,发出抗吞噬信号,阻止巨噬细胞吞噬杀伤肿瘤细胞。我们前期研究发现:人食管鳞癌组织不仅存在CD47蛋白高表达,而且大量巨噬细胞浸润,当用CD47抗体阻断CD47-SIRPα信号后,可增强巨噬细胞吞噬食管鳞癌细胞作用。因此,本研究提出科学假说:化疗药物可能激活食管鳞癌NLRP3炎症小体募集巨噬细胞到肿瘤微环境中,并可能通过CD47-SIRPα信号导致治疗抵抗。综上所述,为探索NLRP3炎症小体对食管鳞癌和治疗抵抗的作用,本课题拟从人食管鳞癌组织标本、人和小鼠食管鳞癌细胞株以及野生型C57BL/6和C57BL/6-Nlrp3^-/-敲除鼠同种移植瘤动物模型三个层面开展研究。首先,明确NLRP3炎症小体在人食管鳞癌组织的表达水平以及临床意义。其次,探讨NLRP3炎症小体对食管鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用和可能机制。最后,探讨NLRP3炎症小体是否募集巨噬细胞并通过CD47-SIRPα信号引起荷瘤小鼠顺铂抵抗。本实验旨在为NLRP3炎症小体成为食管鳞癌免疫治疗新靶点提供理论依据,为研究食管鳞癌免疫微环境和治疗抵抗提供一种新的动物模型。本研究分为以下三部分:第一部分NLRP3炎症小体在人食管鳞癌组织中的表达及其临床意义方法1.收集人食管鳞癌组织和临床病理特征资料本研究收集手术切除的84例成对的原发性手术切除的食管鳞癌组织和癌旁组织为研究对象,并收集患者年龄、性别、原发肿瘤浸润深度和TNM分期、淋巴结转移和远处转移等信息。所有患者术前无放疗和化疗史。2.NLRP3炎症小体及相关蛋白的表达水平和临床意义免疫组织化学法或Western blot法检测食管鳞癌组织中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和Ki67的蛋白表达。ELISA法检测食管鳞癌组织和癌旁组织中IL-1β的分泌。并分析NLRP3和IL-1β蛋白表达水平与患者临床病理特征以及Ki67相关性。3.NLRP3炎症小体及相关蛋白的基因表达水平采用实时定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）法检测NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的m RNA表达。结果1.食管鳞癌组织中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白表达升高与癌旁组织相比,食管鳞癌组织中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β免疫组化染色阳性细胞数明显增加,定位在细胞质。组织化学评分（Histochemistry score,）显示,食管鳞癌组织中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的H-score分值明显高于癌旁组织（P<0.05）。Western blot法也进一步证实:NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表达高于癌旁组织（P<0.05）。ELISA法检测发现食管鳞癌组织中IL-1β浓度高于癌旁组织（P<0.01）。2.NLRP3和IL-1β蛋白表达与患者临床病理特征和Ki67的相关性NLRP3蛋白表达与原发肿瘤浸润深度和TNM分期有关,且差异有统计学意义（P<0.05）,而与患者的年龄、性别、淋巴结转移和远处转移无关（P>0.05）。同时也发现IL-1β蛋白表达与原发肿瘤浸润深度和淋巴结转移有关（P<0.05）。Spearman相关分析结果显示,NLRP3在食管鳞癌患者组织中异常高表达与Ki67高表达呈正相关（r=0.355,P<0.05）。3.食管鳞癌组织中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的m RNA表达与癌旁组织比较,癌组织m RNA表达水平增加两倍以上的患者所占比例依次为:NLRP3占42.86%（18/42,P<0.01）,ASC占54.76%（23/42,P<0.01）,caspase-1占50.00%（21/42,P<0.01）和IL-1β占64.28%（27/42,P<0.01）,其表达水平存在明显个体差异性。第二部分NLRP3炎症小体对食管鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用及可能机制方法1.筛选NLRP3蛋白差异表达的食管鳞癌细胞株以人永生化食管上皮细胞Het-1A作为对照,使用Western blot法比较NLRP3在KYSE70、KYSE510、TE1、TE13、EC9706、EC1和EC109细胞株中的表达,筛选出NLRP3蛋白表达高和表达低的细胞,用于后续实验。2.改变NLPR3基因表达水平,观察其对食管鳞癌细胞生物学特性的影响通过小干扰RNA和转染过表达质粒pc DNA3.1（+）-NLRP3获得NLRP3低表达和高表达的细胞模型。然后利用CCK8法检测细胞增殖活力;通过Transwell和划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室检测细胞侵袭能力。3.利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除TE13细胞的NLPR3基因,观察其对细胞凋亡和上皮间质转化能力的影响构建CRISPR/Cas9靶向敲除NLRP3基因的TE13细胞模型（简称为TE13-Cas9/NLRP3）。通过流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot法检测E-钙粘蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表达,来评估上皮间质转化能力。结果1.NLRP3在不同食管鳞癌细胞的蛋白表达水平与人永生化食管上皮细胞Het-1A相比,TE13和KYSE70细胞NLRP3蛋白表达水平最高,而EC9706和KYSE510细胞表达最低,上述细胞用于后续实验研究。2.NLRP3基因表达的改变对人食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用（1）与si RNA-NC组相比,si NLRP3可使TE13和KYSE70细胞增殖能力下降、穿透基底膜进入Transwell下室细胞数明显减少,细胞迁移速度减慢,划痕愈合减慢（P<0.05）。（2）与空质粒pc DNA3.1（+）-NC相比,过表达质粒pc DNA3.1（+）-NLRP3可使EC9706和KYSE510细胞增殖能力增强、侵袭和细胞迁移速度加快,划痕愈合加快（P<0.05）。3.CRISPR/Cas9靶向敲除NLPR3基因可诱导细胞凋亡、减弱上皮间质转化能力与野生型TE13细胞相比,TE13-Cas9/NLRP3细胞凋亡率增加（P<0.05）,同时Western blot结果显示,E-钙粘蛋白表达升高,而波形蛋白下降,提示靶向敲除NLPR3基因可诱导凋亡,减弱上皮间质转化能力。第三部分NLRP3炎症小体对荷瘤小鼠顺铂抵抗的实验研究方法1.利用野生型C57BL/6小鼠以及C57BL/6-Nlrp3^-/-敲除鼠,构建同种移植瘤模型和顺铂化疗模型培养制备小鼠食管鳞癌细胞（AKR细胞）悬液（1×10⁷个/ml）,每只小鼠按0.1 ml分别接种于野生型C57BL/6小鼠和C57BL/6-Nlrp3^-/-敲除鼠,建立有免疫功能的荷瘤鼠模型。当移植瘤体积达约200 mm³后,将上述荷瘤鼠随机分为模型组和顺铂组,每组入选10只。顺铂组治疗周期方案为:每只小鼠按2 mg/kg剂量给予顺铂,每天腹腔注射一次,共5天,停药2天后,再继续给药5天,建立顺铂化疗模型。模型组腹腔注射等体积生理盐水。每组均绘制移植瘤生长曲线。2.移植瘤组织细胞体外培养回种野生型C57BL/6小鼠,建立多次化疗模型无菌条件下,摘取小鼠移植瘤组织,剪碎成大小约为1 mm³组织,胰酶消化5 min、共2次,然后离心取沉淀贴壁扩大培养。同上法建立多次顺铂化疗模型。3.顺铂治疗后NLRP3表达变化对荷瘤鼠顺铂治疗效果的影响观察比较顺铂治疗后野生型和Nlrp3^-/-敲除型荷瘤鼠移植瘤生长曲线的变化;比较荷瘤鼠多次顺铂治疗前后移植瘤体积的变化,并利用免疫组化及Western blot法检测移植瘤组织中NLRP3和CD47蛋白表达的变化;ELISA法检测荷瘤鼠顺铂治疗前后血清及移植瘤组织中IL-1β的含量变化。4.顺铂治疗后NLRP3表达水平的改变对巨噬细胞募集和CD47-SIRPα信号的影响利用野生型和Nlrp3^-/-敲除型荷瘤鼠建立顺铂化疗模型,免疫组化法检测移植瘤内巨噬细胞标记物CD45和F4/80蛋白表达,分析比较各组H-score分值变化,评估不同NLRP3表达水平和对巨噬细胞募集的影响;Western blot法检测移植瘤组织中SIRPα和CD47蛋白的表达,探讨顺铂治疗前后NLRP3表达改变对CD47-SIRPα信号的作用。结果1.NLRP3表达对顺铂治疗效果的影响与Nlrp3^-/-敲除鼠相比,野生型小鼠移植瘤生长快、体积大。顺铂对野生型小鼠抑瘤率下降（P<0.05）。提示NLRP3表达可促进移植瘤生长,降低顺铂效应。2.多次顺铂治疗野生型荷瘤鼠抑瘤率下降,出现顺铂抵抗与荷瘤模型组移植瘤体积（967.9±53.3）mm³相比,首次和二次给予顺铂治疗周期后移植瘤体积明显缩小,分别为:（423.5±10.3）mm³和（515.2±40.8）mm³（P<0.05）,而第三次给药后瘤体积为（860.23±24.2）mm³（P>0.05）,与模型组无显著性差异（P>0.05）。与模型组瘤重相比,首次和二次给予顺铂治疗周期后移植瘤重量明显减小（P<0.05）。而第三次给顺铂治疗周期后移植瘤重与模型组无显著性差异（P>0.05）。以上结果提示,随着顺铂给药周期增多,抑瘤率下降,荷瘤鼠开始出现顺铂抵抗。3.多次顺铂治疗增加荷瘤鼠移植瘤组织NLRP3蛋白表达和IL-1β含量对三次化疗模型移植瘤组织进行Western blot检测发现:与模型组相比,顺铂组移植瘤组织中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达增多,而且第二次和第三次顺铂周期治疗组NLRP3蛋白表达明显高于首次顺铂治疗组（P<0.05）。免疫组化H-score评分进一步证实:与荷瘤模型组相比,顺铂治疗组NLRP3蛋白随着顺铂治疗周期次数越多,蛋白表达水平越高（P<0.05）。提示:多次给予野生型荷瘤鼠顺铂可激活NLRP3炎症小体,NLRP3蛋白表达升高。ELISA结果显示:顺铂组移植瘤组织中IL-1β含量较模型组明显增高（P<0.05）,提示顺铂可能激活移植瘤组织内NLRP3分泌IL-1β所致。4.野生型荷瘤鼠在多次顺铂周期治疗后CD47蛋白表达增多,联合瘤内注射CD47抗体可逆转顺铂化疗抵抗与模型组相比,顺铂组移植瘤组织中CD47蛋白表达随着顺铂治疗次数增多,表达水平越高（P<0.05）。与单用顺铂组相比,合用CD47抗体瘤内注射,可提高顺铂抑瘤率（P<0.05）。5.NLRP3蛋白表达可促进巨噬细胞募集并高表达SIRPα与CD47作用与Nlrp3^-/-敲除型荷瘤鼠相比,野生型荷瘤鼠移植瘤组织中CD45和F4/80蛋白表达升高,同时western blot检测发现组织中CD47蛋白和SIPRα蛋白表达升高（P<0.05）。与模型组相比,野生型荷瘤鼠顺铂治疗后,移植瘤组织中CD45和F4/80蛋白表达明显升高（P<0.05）,且顺铂组CD47蛋白和SIPRα蛋白表达也较模型组显著升高（P<0.05）。但Nlrp3^-/-敲除型荷瘤鼠在顺铂治疗前后无明显统计学差异（P>0.05）。以上结果提示:顺铂可促进巨噬细胞浸润,并增强CD47-SIRPα信号抑制巨噬细胞吞噬作用。结论1.人食管鳞癌组织中NLRP3高表达,与患者TNM分期和淋巴结转移有关。下调食管鳞癌NLRP3蛋白表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与NLRP3低表达诱导凋亡,减弱上皮间质转化有关。2.顺铂治疗可使野生型C57BL/6小鼠移植瘤组织中NLRP3和CD47蛋白表达上升,抑瘤率下降,引起治疗抵抗。顺铂联合瘤内注射CD47抗体可逆转治疗抵抗。其机制可能与NLRP3募集巨噬细胞浸润,增强SIRPα-CD47信号有关。