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研究背景及目的:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是目前地球上已知抵抗电离辐射最强的生命形式之一。耐辐射奇球菌中总开关因子PprI通过其金属蛋白酶活性对负调控因子DdrO进行切割作用,从而激活其下游多个参与辐射抗性基因,如pprA、ddrD、gyrA等基因的表达,而拥有一个高效的DNA损伤响应能力。PprM是一种参与了PprI依赖的辐射响应的新型调控蛋白,但存在何种依赖关系目前并不清楚。本课题旨在研究PprM蛋白与pprI、recA和pprA之间的关系,进一步了解PprM蛋白参与的PprI依赖的信号途径,从而了解PprM蛋白在耐辐射奇球菌的极端抗性网络中的作用。研究方法:(1)利用课题组前期实施染色质免疫共沉淀(ChIP)结合PCR技术筛选到可能与PprM蛋白发生相互作用的3个关键基因的启动子,即pprI/recA/pprA,诱导p GEX-6p-1-pprM重组载体表达,体外纯化获得GST-Ppr M融合蛋白;(2)设计ppr I/recA/pprA启动子区域上下游引物,合成生物素标记探针,利用凝胶迁移实验(EMSA)验证pprI/recA/pprA启动子探针与GST-PprM融合蛋白是否有相互作用,进一步预测它们的结合序列;(3)利用qRT-PCR检测pprM缺失突变菌株和DR野生菌株中pprI/recA/pprA的m RNA表达水平,了解PprM在转录水平对这三个基因的影响;(4)检测ppr M缺失突变菌株与DR野生菌株在低温条件下的生存曲线。结果:成功诱导表达并纯化到GST-PprM融合蛋白;Ppr M蛋白在体外能够与pprI/recA/pprA启动子区域发生结合作用,pprI启动子的结合序列主要位于第三段探针序列,而recA/pprA启动子的结合序列主要位于各自的第二段探针序列,通过分析,结合序列可能为GCCGTGAA或GACCTGAA;pprM缺失突变菌株中的pprI/pprA的mRNA表达水平高于DR野生菌株,但recA的mRNA表达水平差别不大;pprM缺失突变菌株比DR野生菌株其抗寒能力有所增强。结论:1.EMSA证实PprM蛋白与pprI/recA/pprA三个基因的启动子区域有相互作用,结合序列分别位于pprI启动子的第三段序列和recA/pprA启动子的第二段序列。2.PprM蛋白在转录水平对pprI/pprA基因的表达有一定的抑制作用,但对recA基因没有影响。3.pprM基因的缺失突变导致耐辐射奇球菌的抗寒能力增强。