滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是危害家禽养殖业的重要病原之一。家禽感染后呈长期带菌状态,导致生产性能下降,造成严重经济损失。目前针对MS抗体的检测方法主要有血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test,HI)及酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等方法。HI 试验操作简便、成本低、特异性高,但目前缺少可长期稳定保存的商品化抗原;ELISA灵敏度高、适合大量样品的检测,但进口商品化试剂盒的价格昂贵,检测成本较高。为了给我国MS感染的综合防控与净化提供技术支持,本研究拟研制一种可长期稳定保存的MS冻干血凝抑制试验抗原;同时,以基因工程表达的重组MSPB抗原(rMSPB)作为包被抗原,建立一种可替代国外同类产品的检测MS抗体的间接ELISA方法。1冻干MS血凝抑制试验抗原的研制及应用从本实验室MS流行菌株库中筛选出一株复制能力强、血凝特性稳定的分离株JS2018-4,通过优化抗原灭活工艺、浓缩工艺和冻干工艺,研制出一种稳定性好、特异性强的MS冻干血凝抑制试验抗原,进而优化确定了检测MS抗体的HI试验方法。使用本方法检测了 148份参考血清样品(包含47份SPF鸡阴性血清样品和101份经MS人工感染SPF鸡制备的阳性血清样品),通过受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC)分析结果,确定了相应的判定标准:HI效价≥1:80,判为阳性;1:40≤HI效价<1:80,判为疑似阳性;HI效价<1:40则判为阴性。经检验,该冻干血凝抑制试验试验抗原具有良好的特异性和稳定性,与鸡毒支原体(MG)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)多种病原阳性血清均不发生交叉反应,且于4℃条件下保存12个月仍可维持效价不变。使用该血凝抑制试验抗原建立的HI试验方法和商品化ELISA试剂盒平行检测453份临床血清样品和40份不同抗体滴度的血清样品,结果显示,两者阴阳性符合率分别为100%和77.07%;且两者检测结果呈现的抗体高低趋势一致,表明本研究建立的HI试验方法具备较高的临床应用价值。2基于重组蛋白rMSPB的MS抗体间接ELISA检测方法的建立通过对MS流行株JS2018-4的vlhA基因序列以及氨基酸序列进行分析,选取了抗原性较好的MSPB(6aa-312aa)和MSPA(485aa-720aa)分别进行PCR扩增。通过pET表达系统进行原核表达,获得了 2个携带His标签的融合蛋白。SDS-PAGE鉴定结果显示,2个融合蛋白在BL21(DE3)中均以包涵体形式表达,大小分别为54 kDa和46 kDa,与预期相符;Western-Blot鉴定显示两者均能与MS单因子阳性血清发生特异性反应,分别命名为rMSPB和rMSPA。经过变性、纯化、复性,获得高纯度的重组蛋白作为包被抗原进行ELISA方法的建立。通过比较,使用rMSPB作为包被抗原检测效果优于rMSPA。将重组蛋白rMSPB作为包被抗原,经条件优化建立了检测MS抗体的间接ELISA方法。并制备了 MS标准血清和用于ELISA试验的阴阳性对照样品。使用本方法检测了 676份参考血清样品,通过ROC曲线分析确定了 S/P判定阴阳性的最佳临界值为:S/P=0.45;使用终点滴定法测定其中65份参考血清样品,通过回归分析获得样品最佳稀释倍数处的S/P值与抗体滴度的直线方程:Log10(抗体滴度)=1.148×Log10(1:800 处 S/P 值)+3.247(R2=0.9030),从而实现了对样品中 MS 抗体的快速定量检测。经检验,该方法具有良好的特异性和重复性,与MG、AIV、NDV、IBV等多种病原阳性血清均不发生交叉反应,批内重复和批间重复变异系数均小于10%。使用本方法和商品化抗体检测试剂盒平行检测178份临床血清样品和207份同一鸡群不同日龄的血清样品,结果显示,两者阴阳性符合率分别为99.04%和98.65%;抗体消长趋势基本一致,表明该方法具备良好的检测效果。