目的：在正常的肝脏，肝脏祖细胞（hepatic progenitor cells，HPCs）/卵圆细胞（hepatic ovalcells，HOC）处于休眠状态，然而当肝细胞的增殖受到损伤时（如慢性的肝脏疾病），HPCs/HOC被活化，代替肝细胞介导病理性的肝再生过程，越来越多的研究已经证明HPCs/HOC在HCC的形成中发挥重要的作用，在许多啮齿类的HCC动物模型中已经证实了在HCC的形成前优先出现HOC的增殖，各种各样的化学致癌物诱导的实验性动物肝脏形成肿瘤，其癌变的过程主要为致癌物抑制了正常肝细胞的增殖和修复功能，而卵圆细胞活化、增殖，代替肝细胞的功能修复严重受损的肝脏组织。并且慢性肝脏疾病中出现HPCs的增殖增加了HCC形成的风险。HPCs被发现参与一系列肝脏损伤性疾病，并且在肝纤维化和肝脏肿瘤发生中发挥重要作用。富半胱氨酸蛋白61（Cysteine rich61，Cyr61/CCN1）是CCN蛋白家族成员之一，是分泌型的、细胞外基质蛋白，参与调节细胞的多种生物学进程，如分化、转移、增殖、血管形成、细胞粘附、存活和凋亡。在干细胞中，Cyr61是主要信号通路的介导者。但是，Cyr61和肝脏祖细胞的具体关系仍不清楚。同样Cyr61被发现在多种类型的肿瘤组织中过表达并且在肿瘤形成的过程中Cyr61发挥多种不同的功能。但是目前，Cyr61在HCC中的作用仍存在争议，并且两者的确切关系及其机理尚不清楚。本研究首先分析了HCC组织、癌周肝硬化组织和正常成人肝脏组织中Cyr61的表达和HPCs活化的关系。然后对Cyr61在2-AAF/PHx大鼠肝损伤模型中对HOC活化增殖的作用及其机制进行初步研究。最后，观察并分析了Cyr61调控肝干细胞增殖的作用和机制以及Cyr61对HepG2细胞在NOD/SCID小鼠体内成瘤的作用。本研究不仅为深入研究Cyr61在HPCs/HOC应答以及肝脏肿瘤形成中发挥的生物学效能及机制奠定了基础，并且对寻找肝癌早期诊断的标志物和治疗的靶点具有重要的临床意义。方法：1．病人标本中Cyr61的表达和HPCs活化增殖的关系的研究1.1采用HE、免疫组织化学SP染色法检测5例正常成人肝脏组织，30例癌周肝硬化组织，35例HCC组织中HPCs活化增殖的情况。1.2免疫组织化学SP染色法检测Cyr61在5例正常成人肝脏组织，30例癌周肝硬化组织，35例HCC组织中的表达情况，并进行半定量分析Cyr61表达的差异，分析人肝脏组织中Cyr61表达和HPCs增殖的关系。1.3免疫组织化学SP染色法、免疫荧光双标激光共聚焦检测的方法观察病人标本中Cyr61在活化的HPCs中的表达情况。2．Cyr61在2-AAF/PHx大鼠肝损伤模型中对HOC活化增殖的作用及其机制的初步研究。2.1检测分析2-AAF/PHx大鼠肝损伤模型肝脏组织中Cyr61的表达和HOC活化增殖的关系。2.1.1HE、免疫组织化学SP染色法，检测HOC在2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中活化增殖的情况。2.1.2采用免疫组织化学SP染色、组织透射电镜观察的方法，对2-AAF/PHx大鼠模型肝脏中活化增殖的HOC进行鉴定。2.1.3Western blotting的方法检测Cyr61在2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中HOC活化增殖过程中的表达情况以及β-catenin信号通路的异常激活情况。2.22-AAF/PHx大鼠肝损伤模型中下调Cyr61的异常表达对β-catenin信号通路的抑制作用及HOC增殖的影响的检测及分析。2.2.1应用肝脏原位注射并孵育Cyr61抗体的方法，抑制2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中Cyr61的异常表达。2.2.2Western blotting检测2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中Cyr61是否被抑制。2.2.3Western blotting检测2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中下调Cyr61的表达后，β-catenin以及其下游靶基因cyclinD1表达水平的变化。2.2.4组织HE染色的方法检测2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中下调Cyr61的表达对HOC的激活和增殖的影响。3．Cyr61调节HOC和肝癌细胞株HepG2增殖作用的研究。3.1HOC的分离、培养、鉴定以及Cyr61调控HOC增殖作用及其机制的初步研究。3.1.1两步胶原酶消化法分离培养2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中增殖的HOC；免疫荧光染色法、透射电镜法，对分离的HOC进行鉴定。3.1.2应用HEK293细胞对重组腺病毒AdCyr61、AdRFP进行扩增，细胞感染及滴度测定，并用获得的病毒裂解液感染HOC获得瞬时高表达外源性Cyr61的AdCyr61-HOC以及对照细胞AdRFP-HOC。3.1.3Western blotting检测AdCyr61感染HOC后细胞中Cyr61的表达情况。MTT实验检测Cyr61对HOC增殖的影响。3.1.4Western blotting检测AdCyr61-HOC和AdRFP-HOC中β-catenin信号通路的活化情况。3.1.5分别用AdCyr61瞬时感染和抗体封闭的方法过表达和抑制HOC中Cyr61的表达后，用双荧光素酶报告基因的方法检测β-catenin/TCF转录活性的变化。3.2NOD/SCID小鼠皮下瘤实验观察分析体内Cyr61对HepG2细胞成瘤作用的影响。3.2.1人肝癌细胞株HepG2分别被AdCyr61、AdRFP感染36h后，分别采用RT-PCR、Western blot的方法检测感染AdCyr61的实验组HepG2细胞中Cyr61的mRNA和蛋白的表达和对照组细胞AdRFP-HepG2相比是否上调。3.2.2将AdCyr61-HepG2细胞和AdRFP-HepG2接种于NOD/SCID小鼠皮下，观察Cyr61对皮下瘤生长的影响并绘制皮下瘤成长曲线。3.2.3采用HE、免疫组织化学SP染色法分别检测Cyr61对HepG2皮下瘤形态的影响以及核增殖因子Ki67的变化。结果：1．5例（100%）正常成人肝脏组织中均未发现门脉周围HPCs和非典型小管样增殖(atypical ductular proliferations, ADP)反应；30例（100%）癌周肝硬化组织中均出现明显的HPCs的激活和ADP反应；25例（71%）HCC组织中存在HPCs的激活和ADP反应。并且在癌周肝硬化和HCC组织中，增殖的HPCs起源于肝门脉区域，随着门脉炎症程度加重，HPCs及小管样反应从肝硬化结节或癌结节周围向肝实质扩散。2．Cyr61在癌周肝硬化组织中的表达明显升高，并且在增生的间质中可见大量激活的单个HPCs和呈小管样反应的HPCs，Cyr61在其中也均为强阳性表达；HCC中癌结节周围的间质中也出现了HPCs的大量增生和同样的小管样反应，周围伴有炎细胞浸润，并且Cyr61在HPCs中的表达和癌细胞相比显著增高。3．HE染色观察细胞形态和免疫组织化学SP染色法检测HPCs标志蛋白OV6，共同分析病人标本中出现HPCs激活和ADP反应的情况，发现HPCs激活和增殖的程度与Cyr61表达的升高相伴随，并且Cyr61和OV6在HPCs中共表达。4．2-AAF/PHx大鼠模型中，部分肝切除(partial hepatectomy, PH)后第2d在门脉区就出现HOC的增殖，主要为单个或散在的HOC，PH后第9d，HOC进一步活化增殖，形成的小管样结构大量增加，侵入肝实质中部，OV6免疫组织化学SP染色胞浆呈强阳性表达，第21d已经基本恢复正常。5．Cyr61在2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中HOC活化增殖过程中的表达上调，Cyr61的表达在PH后第1d即开始增高，PH后第3d、5d、7d达高峰，PH第9d后逐渐恢复正常值。6．β-catenin信号通路在2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中HOC活化增殖过程中异常激活，其关键分子GSK-3β的表达没有发生变化，但是其发生磷酸化与Cyr61的异常表达一致，并且β-catenin的激活也和Cyr61的异常表达相伴随。β-catenin信号通路下游和HOC增殖相关的靶基因CyclinD、Survivin和Cyr61的异常表达也一致，均伴随着HOC的活化增殖而升高。7．下调2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中Cyr61的表达可以抑制β-catenin、CyclinD的异常表达并使HOC的增殖减少。8．PH后第9d的2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中分离培养了增殖的HOC并进行了鉴定和培养，过表达外源性的Cyr61后，GSK-3β的磷酸化水平升高呈失活形式，β-catenin的磷酸化水平降低而活性升高，外源性的Cyr61可以促进细胞增殖并可以使β-catenin/TCF的转录活性显著升高，并且β-catenin下游靶基因CyclinD、Survivin的表达升高。9．外源性的Cyr61可以促进肝癌细胞株HepG2在NOD/SCID小鼠皮下瘤的生长，并且使皮下瘤组织Ki67的表达增多，提示Cyr61在体内可以促进HCC的生长。结论：1．在正常肝组织中无门脉周围HPCs和ADP增殖。在癌周肝硬化和HCC组织中，增殖的HPCs起源于肝门脉区域，随着门脉炎症程度加重，HPCs及小管样反应从肝硬化结节或癌结节周围向肝实质扩散，并且Cyr61在激活的HPCs中表达异常增高。提示Cyr61在HCC形成过程中发挥的重要作用可能和HPCs的激活有密切的关系。2．2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中Cyr61的表达在HOC活化增殖的过程中明显升高，当HOC分化为正常肝细胞或胆管细胞后又恢复正常水平，并且β-catenin信号通路的异常激活和Cyr61的升高相伴随，提示Cyr61可能和β-catenin协同作用，在激活HOC，促进其增殖方面发挥重要的作用，并共同促进HOC的活化增殖；采用抗体封闭的方法下调2-AAF/PHx大鼠模型肝脏组织中Cyr61的表达可以抑制β-catenin信号的异常激活并使HOC的增殖减少，提示Cyr61对HOC活化增殖作用可能依赖于β-catenin的异常激活启动下游靶基因来实现。3．外源性Cyr61在体外可以促进HOC的增殖，并可以减少β-catenin的磷酸化降解，调节β-catenin/TCF转录活性，促使其作用于下游增殖因子发挥作用；外源性的Cyr61可以促进肝癌细胞株HepG2在NOD/SCID小鼠皮下瘤的生长，并且使移植瘤组织Ki67的表达增多，提示Cyr61在体内可以促进HCC的生长。