流行性乙型脑炎(epidemicencephalitisB)，简称乙型脑炎或乙脑，是由乙型脑炎病毒(encephalitisBvirus)又称日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)引起的一种中枢神经系统急性传染病，也是一种人畜共患的自然疫源性疾病。该病自1924年于日本发现流行后，虽然随着疫苗接种的普及，发病率大大降低，但全球每年病死人数仍超过万人。及时准确的早期诊断是降低病死率和改善预后的关键。目前，乙脑诊断主要依靠血清学方法，由于抗体产生需一定时间，而且与其他黄病毒间存在血清学交叉反应，不足以进行早期诊断，急需建立一种敏感、特异的早期诊断方法。国内外学者应用聚合酶链(PCR)技术，用于各种病原体的诊断，发现其具有敏感、特异的特点，值得推广应用。 目的：1.建立一种新的敏感性高、特异性强的检测JEVRNA的方法—RT-semi-nested-PCR，并对该方法在临床标本检测中的应用进行评价。 2.分析新建立的RT-semi-nested-PCR与IgM捕获法ELISA(MacELISA)的相关性，评价两种方法在临床标本检测中的应用。 方法：随机收集临床诊断的37例乙脑和15例非乙脑病人标本(包括血清、脑脊液)分别为63份和30份，同时用RT-semi-nested-PCR、MacELISA进行检测。 1.RT-PCR方法：根据已发表的JEV序列(GenbankaccessionnumberAF221500、AB028268)，应用引物设计软件(DNAStar)在3'端非编码区(non-codingregion，NCR)设计半套式引物。总RNA提取试剂盒自标本中提取JEVRNA，在AMV逆转录酶作用下逆转录为cDNA，应用所设计引物经两轮扩增，电泳后若有特异性条带出现，且大小与阳性对照或分子量标准一致即判为阳性，证明扩增成功。设疫苗为阳性对照，无菌蒸馏水为阴性对照。 2.MacELISA：按照试剂盒说明书操作。经酶联免疫检测仪检测，阳性抗原孔OD值/阴性抗原孔OD值即P/N≥2.1判为阳性。 3.统计方法：计数资料以频数和率值表示，进行四格表X2检验(Fisher精确检验，双侧检验)。计数资料相关性分析以相关系数r表示，进行Kendall等级相关分析。以上统计均由SPSS10.0软件包进行。 结果：除疫苗第一次PCR扩增可出现相应电泳条带外，临床标本第一次PCR均未见相应电泳条带。经第二次PCR扩增后，阳性标本出现特异性条带，与预计值400bp完全符合。 1.MacELISA、RT-PCR检测乙脑、非乙脑病人血清标本阳性率的比较：MacELISA检测乙脑病人血清标本阳性率59.0％，明显高于非乙脑病人血清标本阳性率6.7％；RT-PCR检测乙脑病人血清标本阳性率51.3％，明显高于非乙脑病人血清标本阳性率0％，经X2检验(Fisher精确检验)，P＜0.01，均有极显著性差异。MacELISA检测血清标本敏感度为59.0％，特异度为93.3％；RT-PCR检测血清标本敏感度为51.3％，特异度为100％。 2.两种方法检测乙脑病人血清标本的相关性分析：相关系数r=0.439，P=0.007，有显著相关性。 3.两种方法检测乙脑、非乙脑病人脑脊液标本阳性率的比较：MacELISA检测乙脑病人脑脊液标本阳性率为0％，非乙脑病人脑脊液标本阳性率为6.7％，P=0.385，无显著性差异。RT-PCR检测乙脑病人脑脊液标本阳性率为50％，非乙脑病人脑脊液标本阳性率为0％，P=0.001，有显著性差异。MacELISA检测脑脊液标本的敏感度为0％，特异度为93.3％；RT-PCR检测脑脊液标本的敏感度为50％，特异度为100％。两种方法检测乙脑病人脑脊液标本24份，MacELISA均阴性，RT-PCR阳性12份，明显高于MacELISA。 4.标本采集时间对两种方法检测乙脑病人血清、脑脊液标本阳性率的影响：MacELISA检测＞5天采集的血清标本阳性率60.7％高于≤5天的阳性率54.5％，但无显著性差异。RT-PCR检测≤5天采集的血清标本阳性率81.8％高于＞5天的阳性率39.3％，有统计学意义。RT-PCR检测脑脊液标本≤5天的阳性率56.3％高于＞5天的阳性率37.5％，但无显著性差异。 5.两法检测乙脑、非乙脑病人阳性率比较：MacELISA检测乙脑病人阳性率59.5％，明显高于非乙脑病人阳性率13.3％，P=0.002，RT-PCR检测乙脑病人阳性率67.6％，明显高于非乙脑病人阳性率0％，P=0.0001，均有显著性差异。MacELISA检测敏感度59.5％，特异度86.7％，RT-PCR检测敏感度67.6％，特异度100％。 6.两法检测乙脑病人相关性分析：相关系数r=0.430，P=0.01。 结论：1.RT-semi-nested-PCR对检测JEV感染，从实验设计到实验条件，都是合理的。有较高的敏感性和特异性。可用于乙脑、啡乙脑病人的鉴别。 2.JEV在血、脑脊液中含量低。 3.进一步证明MacELISA适用于乙脑诊断，对非乙脑病人有鉴别诊断意义。 4.JEV病毒血症期短，注意标本采集时间，否则将影响实验结果。RT-PCR用于血清标本的检测宜尽早进行，有助于提高阳性率。