[研究背景]随着人口老龄化的逐渐加速,生存环境的质量下降,全球的癌症压力越来越大。据GLOBOCAN统计,2008年约有1.27千万新发癌症患者,约有7.6百万人口死于癌症。宫颈癌是全球妇女中排名第二的恶性肿瘤,是最常见的女性生殖道肿瘤。自20世纪50年代以来,由于宫颈癌的细胞学筛查及病毒检测指南的不断更新,使得宫颈癌的发病率及病死率明显下降。但在2011年公布的全球宫颈癌新发病例仍约有52.9万例,死亡病例约27.5万,其中80%新发病例和85%的死亡病例发生在发展中国家。而我国高达28.8%,发病年龄以40～50岁为多,60～70岁又有一个发病高峰,该趋势严重地威胁着女性身心健康,正逐渐成为全社会关注的焦点,是医学界深入探讨的重中之重,为宫颈癌患者寻找有效的治疗模式显得尤为重要。宫颈癌的主要治疗手段是手术及放化疗,近年来化疗作为宫颈癌综合治疗的重要组成部分越来越受到国内外学者的重视。为使肿瘤患者有较好的预后,降低复发率,减少放化疗的副反应,提高患者生活质量,人们不断探讨宫颈癌的治疗模式,重点关注患者的自身内环境,逐渐形成了肿瘤营养学的治疗模式。许多流行病学调查及体内外实验研究显示膳食补充co-3 PUFAs能够预防和改善多种炎症和肿瘤疾病。2009年美国肠外内营养学会(ASPEN)发布的肿瘤病人及相关支持治疗的新指南指出,鼓励病人正常自然进食、口服辅助营养、人工EN或PN,依据不同的疾病状态,可以有效改善病人的营养状况,提高免疫功能,纠正器官功能不全,营养支持已成为肿瘤综合治疗一个重要的组成部分,指南中关于肿瘤患者与摄入ω-3PUFAs的相关性研究发现,并指出ω-3PUFAs可以维持肿瘤患者体重,增强免疫力等。许多流行病学研究还显示ω-3PUFAs对于婴儿发育、癌症的预防及治疗、心脑血管疾病有积极的作用；最近研究亦表明其在包括抑郁症、痴呆等各种精神疾病中亦有积极作用。这些不饱和脂肪酸具有多重效应,包括抗炎、抗血小板聚集、降压和降血脂,其效应可能通过多种不同的机制发生,包括影响细胞膜成分和功能,基因表达或产生类十二烯酸等。肿瘤营养学研究除了关注营养物质对肿瘤患者体重、免疫力等方面的影响外,逐渐也开始关注营养物质对肿瘤细胞增殖、转移以及相关物质对放化疗敏感性的研究。研究初期,学者们主要通过在术前给予择期手术的患者口服或静脉给予ω-3PUFAs来探讨其对术后感染率、住院时间等相关指标的影响。Lone S. Sorensen等发现术前给予不饱和脂肪酸对术后并没有明显的临床积极作用,但是Wachtler等研究发现术前给予不饱和脂肪酸后可以减少术后并发症。这些研究结果的不一致性可能与患者接受不饱和脂肪酸的摄入时间、摄入量及研究方法的不同有关,不饱和脂肪酸对预后是否有影响则需要更多的临床研究,提供科学的临床依据。近二十年来,人们更为关注的是针对ω-3PUFAs的DHA和EPA对于肿瘤的防治作用。通过不同体内外的研究,发现ω-3不饱和脂肪酸(EPA和DHA)对于前列腺癌、乳腺癌、直肠癌、膀胱癌等肿瘤细胞有积极的生物学效应,并可以降低直肠癌、前列腺癌和乳腺癌等癌症的患病率。针对肿瘤细胞增殖或凋亡研究中,Abdi, J等发现DHA和EPA可为促进多发性骨髓瘤细胞的凋亡并能增强此类细胞对化疗药物的敏感性,同时却不影响正常细胞的生物学功能,ALICJA ZAJDEL等人通过AA,EPA和DHA作用于体外培养的多种人黑色瘤细胞进行研究,他们发现这些脂肪酸的抗细胞增殖作用要根据脂肪酸的种类及细胞系的类型不同而不同。Belmiro Parada等通过诱导大鼠膀胱癌模型时发现ω-3脂肪酸抑制癌前病变和恶变组织的发展,其中的机制可能是由于其抗炎、抗氧化、抗增殖和抗血管生成的特性所致的。研究发现PUFAs除了具有促进肿瘤细胞凋亡的作用外,还可以增强肿瘤细胞对化学药物的敏感性,这一研究成果既可改善耐药细胞对化疗药物的敏感性,还能减少化疗药物的剂量,降低化疗药物副反应的发生率。GaelleBenais-Pont等通过体外直肠腺癌细胞的研究发现ω-3PUFAs可能作为一种营养佐剂增强人直肠腺癌的放疗作用。Flavia De Carlo等通过对直肠癌干细胞样细胞与EPA的研究发现EPA可以增强直肠癌320DM细胞系对标准化疗药物(5-氟尿嘧啶和奥沙利铂)的敏感性。Anita Vasudevan等人也研究发现EPA可以通过自身或氟尿嘧啶联合作用而作为复发性直肠癌的有效的防治策略。虽然ω-3PUFAs在防治肿瘤中具有多重积极的生物学效应,但是它作用于肿瘤细胞的机制尚不明确,不同研究团队通过在不同肿瘤或者在同一肿瘤的研究中所得出的作用机制也不尽相同。Elena Fasano等研究发现DHA通过降低GRP78蛋白(内质网的其中一个成分蛋白,可能是DHA的一个分子目标)的表达来发挥它在直肠癌细胞中的凋亡和抗肿瘤效应。Jeffrey D.Altenburg等在MDA-MB-231乳腺癌细胞株中研究发现EPA和DHA可以通过下调细胞表面受体CXCR4的表达而降低由CXCR4介导的癌细胞转移。Arun Sharma等通过对卵巢上皮细胞癌中的SKOV-3和OVCAR-3细胞株的研究发现ω-3不饱和脂肪酸对卵巢癌细胞的抗增殖作用是多样的。在某些条件下,它的抗增殖作用可能是由TGF-p通路介导的,这个由ω-3不饱和脂肪酸影响发挥效应的TGF通路也可能与P21蛋白的调控有关。Masayuki Fukui等通过体内与体外对胰腺癌细胞研究发现EPA可以通过诱导胰癌细胞自噬而发挥它的抗肿瘤作用,但是具体的机制尚不清,可能与ROS水平和caspase蛋白表达相关。DHA (Docosahexaenoic acid.二十二碳六烯酸)作为ω-3PUFAs中最重要的一种营养成份,除可以抗炎、抗动脉粥样硬化、促进胎儿神经系统发育作用外,越来越多的证据表明其可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,但其药理作用复杂,抗肿瘤作用的机制尚不明确,国内有研究表明DHA可能通过mTORC1/2信号通路抑制子宫内膜癌生长,而ω-3不饱和脂肪酸对妇科肿瘤细胞的影响的研究尚鲜有报道。[研究目的]1.初步探讨多不饱和脂肪酸DHA对宫颈癌细胞株凋亡的影响；2.初步探讨多不饱和脂肪酸DHA对宫颈癌细胞株侵袭、转移的影响。[研究内容及方法]取对数生长期的Hela、Siha细胞,分为空白对照组、不同浓度DHA刺激组：1.DHA在体外对宫颈癌细胞株凋亡的影响：(1)采用MTT法检测宫颈癌细胞在0μmol/L、20μumol/L、40μmol/L、 60μmol/L、80μmol/L、100μmol/LDHA的浓度下作用24h、48h、72h后,对宫颈癌细胞活力的抑制效应;(2)通过倒置显微镜,观察在0μmol/L、IC25、IC50、IC75浓度下的DHA作用于宫颈癌细胞48h后的形态学改变；(3)采用Hoechst33258染色液染色法观察0μmol/L、IC25、IC50、IC75浓度下的DHA作用于宫颈癌细胞48h后引起的凋亡形态学改变；(4)使用Annexin V/FITC双染试剂盒,通过流式细胞学检测(FCM)0μmol/L、IC25、IC50、IC75浓度下的DHA作用于宫颈癌细胞48h后引起的细胞凋亡率的变化情况；(5)采用蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测0μmol/、IC25、IC50、IC75浓度下的DHA作用于宫颈癌细胞48h后凋亡蛋白(Bax、Bcl-2、 Cleaved-Caspase 3)的表达情况；2.DHA在体外对宫颈癌细胞株侵袭、转移的影响：(1)采用划痕迁移试验观察不Opmol/L、IC25、IC50浓度下的DHA作用于宫颈癌细胞48h后,细胞体外水平迁移能力的改变；(2)采用transwell小室迁移和侵袭实验观察0μmol/L、IC25、IC50、IC75浓度下的DHA作用于宫颈癌细胞后,细胞体外垂直转移和侵袭能力的改变；(3)采用蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测Opmol/L、IC2、IC50、IC75浓度下的DHA作用于宫颈癌细胞48h后侵袭、转移相关蛋白(VEGF、MMP-9)的表达情况。3.统计分析：采用SPSS 13.0软件进行统计分析,所有数据均以均数±标准差表示,多组间采用One-way ANOVA进行统计,两两比较使用LSD检验,P值小于0.05表示差异有统计学意义。[研究结果]1、通过MTT法检测细胞活力发现,与对照组(0μmol/LDHA)比较,不同浓度DHA对宫颈癌细胞株HeLa细胞及Siha细胞的细胞活力均有明显的抑制作用,且作用效果随药物浓度升高或作用时间延长而越明显,呈时间-浓度依赖性(P<0.05)。2、倒置显微镜下,与对照组(0 μmol/L DHA)相比,两宫颈癌细胞株经不同浓度DHA溶液刺激48小时后,细胞形态发生明显改变。对照组中,Siha细胞呈长条梭形、单个细胞生长；而HeLa细胞则呈不规则梭形并呈癌巢状聚团生长。在IC25组,细胞形态开始出现变化,细胞变圆,未见细胞明显增殖,大部分细胞胞浆变得透亮。在IC50组,培养基上清中可见漂浮着透亮的死细胞,细胞间隙进一步增宽,细胞皱缩,细胞浆内及细胞核周围出现较多的透亮的颗粒,部分细胞己成细胞碎片。而在IC75组,视野下较少见到正常细胞,多为细胞碎片或细胞浆内出现如脂质般的颗粒。光学显微镜下所见的细胞形态改变,表明DHA对宫颈癌细胞株具有较强的细胞毒性作用,且毒性作用呈现浓度依赖性。3、Hoechst 33258染色后于荧光显微镜下观察,对照组(0 μmol/L DHA)中,两细胞株的细胞核形态呈圆形,染色均匀一致,边缘清晰,可见HeLa细胞呈聚团样生长,而Siha细胞则单个细胞生长。随着DHA浓度的升高,细胞出现了凋亡经典的核固缩、核碎裂、染色质凝集、凋亡小体形成等凋亡现象。结合光镜下的细胞形态学改变及染色后细胞核的凋亡改变,进一步证实了DHA对宫颈癌细胞的毒性作用。4、使用Annexin V-FITC/PI双染后经FCM结果显示,不同浓度DHA作用于细胞48h后,各处理组之间的细胞凋亡率差异具有统计学意义,随药物浓度增加,凋亡率提高,进一步验证了DHA能通过促进宫颈癌细胞凋亡进而抑制宫颈癌细胞活力,其抗肿瘤效应是呈浓度依赖性。5、在细胞划痕实验中,细胞划痕48h后,与实验浓度组相比,划痕处的面积修复明显比空白对照组弱,尤其是在Siha细胞中,对照组面积已完全愈合,而药物处理组的划痕恢复速度明显弱于对照组;而在transwell小室迁移实验中,随着DHA的作用浓度升高,穿过上室底膜而进入下室的细胞数目越少,亦提示DHA可以抑制HeLa细胞和Siha细胞的迁移能力。细胞划痕实验及transwell小室迁移实验结果提示,不同浓度的DHA可以抑制宫颈癌细胞的迁移能力,且浓度越高,抑制能力越强。6、Transwell小室侵袭实验中,DHA作用于HeLa细胞和Siha细胞48h后,细胞的侵袭能力下降,且随着DHA作用浓度的提高,HeLa细胞和Siha细胞的侵袭能力呈浓度依赖性下降。7、Western Blotting提示,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显降低(P<0.05),而促凋亡蛋白Bax表达量则明显增加(P<0.05), Bcl-2与Bax表达量的比值下降；cleaved caspase-3的表达量亦随着浓度梯度的升高而增加(P<0.05)；细胞侵袭转移相关蛋白血管内皮因子(VEGF)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达量随着DHA作用浓度的升高而表达量降低(P<0.05)。Bax、Bcl-2及cleaved-caspase 3的表达量情况与MTT、Hoechst 33258染色、流式细胞学结果相符；而VEGF、MMP-9的表达量结果与细胞划痕实验、transwell、室迁移侵袭实验结果相符。[结论]DHA可通过调控cleaved-caspase 3、Bax及Bcl-2蛋白的表达情况从而促进宫颈癌细胞的凋亡；除此之外,亦能通过降低MMP-9、VEGF蛋白的表达而降低宫颈癌细胞的迁移能力,抑制宫颈癌细胞的侵袭。Bax、Bcl-2是细胞线粒体膜上的特异性蛋白,由此推测DHA有可能是通过线粒体途径促进宫颈癌细胞的凋亡。