CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因及靶向突变检测方法的研究

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香稻因其宜人的香味而受到全世界的青睐。传统的育种方式在一定范围内能够提高水稻产量和米质,但是效果不够显著,且工作量大,工作周期长。CRISPR/Cas编辑技术的发现和应用为分子育种开辟了新的途径。因编码甜菜碱醛脱氢酶基因BADH2功能缺失后,可导致一个主要的香气化合物2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量增多,使稻米产生香味。因此,本文利用CRISPR/Cas9靶向编辑技术,针对BADH2第2外显子和第7外显子分别设计靶标位点Badh2KO1和Badh2KO2,通过水稻遗传转化共获得转基因植株94株。通过对94株转化植株的BADH2基因测序结果可知,Badh2KO1的突变植株为25株,突变率27%;Badh2KO2的突变植株为59株,突变率63%;野生型植株为10株。通过遗传分离得到纯合突变植株。Sanger测序证实这些突变植株中BADH2基因发生碱基缺失和插入,致使编码蛋白的氨基酸序列均有不同程度的改变,且GC-MS技术检测出这些突变植株中的2-AP含量明显提高。这些结果表明,CRISPR/Cas9可以定向编辑水稻香味基因,使稻米具有香味。突变检测是植物CRISPR/Cas9靶向突变研究的必要环节。为了比较不同检测方式的特点,本研究以一个水稻T0代CRISPR/Cas9靶向群体为材料,比较了目前常用限制性内切酶片段长度多态性分析、T7核酸内切酶分析、单链构象多态性分析、高分辨率溶解曲线分析以及直接测序分析等5种检测手段的准确性和灵敏性。我们的结果表明这些方法检出阳性结果的真实性均较高,但检出能力存在一定差别;进而我们也讨论了不同方法间实验周期和经济成本的差异。我们的工作为植物CRISPR/Cas9靶向编辑检测方法的选择提供了帮助。
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