论文部分内容阅读
目的:树突状细胞(Dendritic cell,DC)是专职抗原提呈细胞,并且在多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)以及动物模型的发生发展中起关键作用。近来,随着对DCs的深入研究,DCs不仅在启动免疫反应中起着关键作用,它本身也有维持外周免疫耐受、调节免疫反应的作用,因此提出了耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells,tolDCs)的概念。最近研究发现在米诺环素存在的条件下小鼠骨髓源性树突细胞显示出tolDCs的特征,并且其树突细胞的数量高于对照组,尤其表现出不成熟的DCs特征,不易于被脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导成熟。目前米诺环素诱导耐受性树突状细胞的机制不清。在本研究中通过米诺环素诱导tolDCs,检测米诺环素是否是通过阻断LPS-TLR4/NF-κB信号传导通路进而增加树突状细胞耐受性,为米诺环素治疗多发性硬化方面提供更加切实有效的证据。方法:1.将小鼠骨髓源性树突状细胞(bone marrow-derived cell,BMDC)进行体外培养。应用改良Son方法将小鼠BMDC进行体外培养,且分成3组:LPS-DC:于体外培养至第6天的BMDC用LPS(1μg/ml)刺激24h,诱导未成熟树突状细胞成为成熟树突状细胞。Mino-DC:于体外培养至第0天、第2天和第4天的BMDC加入5μm的米诺环素,培养至第6天用LPS(1μg/ml)刺激24h,诱导未成熟树突状细胞成熟。Ctrl-DC:于体外培养至第7天的BMDC,不进行药物干预以获取第7天未成熟的DC。将上述3组细胞培养至第2天时进行半量换液,培养至第4天时进行全量换液,并且每次换液时补充10ng/ml IL-4和GM-CSF。2.单向混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR)。将源于C57BL/6小鼠以上3组细胞作为刺激细胞,应用CD11c MACS进行分离纯化。将Balb/c小鼠的纯化CD4~+T细胞作为反应细胞。将刺激细胞与反应细胞的以不同比例细胞混合培养在96孔板中,混合培养共达72 h,按说明书要求加入CCK-8试剂。3.应用荧光倒置显微镜和扫描电镜观察细胞的形态,应用透射电镜观察细胞内的超微结构。4.进行流式细胞学检测。培养至第7天时分别收集以上3组细胞,调整细胞浓度,分别加入流式抗体进行染色,4℃避光孵育30 min,等待上机检测。5.分别取以上各组细胞,提取细胞总蛋白,用10%SDS聚丙烯酰胺胶进行电泳;低温转膜,封闭,一抗孵育过夜。第二日,二抗孵育1h,扫膜显影,再定影。6.双抗体夹心酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测培养至第7天的各组细胞上清中IL-12p70、TNF-α和IL-10水平。7.应用SPSS 21.0进行统计学分析。结果:1.Ctrl-DC组与Mino-DC组的细胞形态相似,为类圆形,突起稀疏又短小。而LPS-DC组的细胞形态则是不规则,并且表面皱褶层叠多而深大,突起较大、稠密又长,似树枝状。2.与LPS-DC组相比,Mino-DC组细胞胞质内高尔基体、内质网、线粒体等细胞器比较少。3.流式细胞学检测细胞表面分子Mino-DC组中细胞表达的CD80和CD86水平是介于未成熟Ctrl-DC组与成熟LPS-DC组之间(P<0.01)。与LPS-DC组相比Mino-DC组细胞表面分子MHC II表达则类似(P>0.05)。4.使用混合淋巴细胞反应测定法分析Mino-DC组引发同种异体T细胞的能力。结果表明LPS-DC组可有效诱导同种异体T细胞的增殖。在DC与T细胞比率为1:5时观察到最大刺激活性(P<0.01)。然而,Mino-DC的同种刺激活性介于Ctrl-DC与LPS-DC之间(P<0.05)。5.LPS诱导的Mino-DC中TLR4(P<0.01)、NF-κB-p65(P<0.05)蛋白的表达水平低于LPS-DC和Ctrl-DC。而IκB-α(P<0.01)表达水平高于其余两组。6.用ELISA检测3组细胞分泌的细胞因子水平。Mino-DC组分泌致炎性细胞因子如IL-12p70、TNF-α的水平介于LPS-DC组和Ctrl-DC组之间(P<0.01),IL-10比其余两组都高(P<0.01)。结论:1.米诺环素可能抑制BMDC的成熟,使其处于半成熟状态,并抑制T细胞增殖。2.米诺环素通过阻断LPS-TLR4/NF-κB信号传导通路进而增加树突状细胞耐受性。