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化疗是癌症治疗的重要手段之一,但化疗药物通常缺乏选择性,对正常组织毒副作用严重制约了其在临床的应用。聚合物纳米药物是将药物分子与聚合物通过化学键合或物理包封形成“载体-药物”为形式的体系,能够运送药物至特定的部位,具有提高靶部位的药物浓度和药物的有效利用率,降低毒副作用等优势,成为有效的抗肿瘤药物运载体系。目前常用的聚合物药物载体有聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）、聚乳酸-羟基乙酸共聚（PLGA）等,但仍存在水溶性差,携带的药物分子在体内释放较慢;可修饰基团少,难以满足高载药率及载体功能化修饰的要求等问题。β-聚苹果酸（Polyβ-malic acid,PMLA）是以三羧酸循环中间产物L-苹果酸为单体通过酯键聚合而成的高分子聚酯,在体内可最终降解为水和二氧化碳代谢出体外,其在生理条件下具有无免疫原性、高自发降解速率和高溶解性等特性,使它成为优于多肽或多糖等生物高分子的一种新型聚合物载体材料。本课题组前期开展了PMLA用作药物载体的系列研究,发现由于PMLA较强的负电性,对携带抗肿瘤药物入胞有一定的影响。虽然配体-受体介导方式可提高载体携带药物入胞的能力,但难以使纳米药物渗透到肿瘤深部。细胞穿膜肽是一类具有生物膜穿透功能的多肽,可以携带其本身数倍乃至数十倍分子量的物质进入细胞,但因缺乏特异性,在药物载体的应用中受到制约。本文综合考虑上述研究背景,以β-聚苹果酸（PMLA）为载体,TAT增强PMLA作为药物载体的入胞能力。首先筛选了一定分子量聚苹果酸载体中TAT的用量和屏蔽TAT的PEG5000的优化含量,通过肿瘤组织pH、特异性酶与正常组织的差异,实现穿膜肽去屏蔽,并对TAT屏蔽/屏蔽灵敏性进行研究。主要工作如下:一、PMLA-Hyd-PEG5000/PEG2000-TAT/DOX（PHPTD）的制备以L-天冬氨酸为原料,制备出β-苄氧羰基-β-丙内酯,进而通过阴离子开环聚合后氢化最终得到PMLA（53kDa）。以PMLA为药物载体,DOX为模型药物,制备出8组不同TAT含量的PMLA-PEG2000-TAT/DOX（TAT含量:0,0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,1%,2%,nTAT:nPMLA-COOH,下同）。利用酸敏腙键和酰胺键（对照组）将不同含量mPEG5000-CHO与PMLA连接用于保护TAT,制备8组不同PEG5000含量的纳米接枝物PHPTD(PEG5000含量为0,2%,2.4%,2.8%,3.2%,3.6%,4%,6%,TAT含量为0.3%)。核磁共振氢谱表征中间产物及最终产物;通过粒度分析仪测定PHPTD的粒径为90nm,Zeta电位为-21.6mV。二、PHPTD中TAT和PEG含量的筛选筛选TAT发挥良好穿膜作用的最少含量和用于屏蔽/去屏蔽TAT的PEG5000的合适含量。细胞毒实验筛选出纳米接枝物中发挥穿膜作用的最小TAT含量为0.3%时即可发挥最大功效;以TAT含量0.3%为基准,合成出不同含量PEG5000的纳米接枝物后,分别通过核磁共振氢谱和体外细胞毒性实验筛选PHPTD中合适的PEG5000含量为3.6时可对TAT有较好的保护效果。三、PHPTD-3.6中TAT的屏蔽/去屏蔽作用研究及共聚物载体高效入胞特性以0.5h和4h为时间节点,利用生物学方法（细胞内摄方法）和化学方法（核磁共振氢谱表征）检测PHPTD中TAT屏蔽/去屏蔽的灵敏性。将PHPTD-3.6置于PBS溶液中0.5h和4h后核磁图谱表征,TAT特征峰消失;通过细胞内摄实验可看出PHPTD-3.6在0.5h和4h入胞率均较低说明PEG5000在pH7.4时可有效屏蔽TAT。而在pH6.5时,核磁共振氢谱中出现TAT特征峰,结合细胞内摄实验可看出PHPTD-3.6入胞率提高,说明在pH6.5时TAT可有效去屏蔽后发挥穿膜作用。细胞毒研究证实PHPTD-3.6在pH6.0时对MDA-MB-231细胞和Hela细胞的毒性较强、內摄效果最好。体内抗肿瘤结果表明,PHPTD-3.6的体内抗肿瘤活性较好。四、酶/pH双重敏感胶束的合成及体内外生物学研究研究表明TAT能有效提高PMLA作为载体的入胞能力,但是其在体内长循环过程中对TAT屏蔽稳定性及释药速率有待提高。本研究基于第一部分的筛选TAT与PEG5000含量的实验结果,以PMLABn为药物载体,引入豆蛋白酶敏感AANL肽将mPEG5000-NH2与PMLABn连接,氢化后通过顺式乌头酸键连接DOX,制备PEG5000-AANL-PMLA-CAD（PAPC）用于屏蔽TAT;通过MAL-PEG2000-NH2将细胞穿膜肽TAT与PMLABn相连,氢化后将DOX通过pH敏感顺式乌头酸键相连,得到TAT-PEG2000-PMLA-CAD（PPTC）;将PEG2000与PMLABn相连,氢化后利用顺式乌头酸建连接DOX得到PEG2000-PMLA-CAD（PPC）,核磁共振氢谱及红外光谱表征产物。通过控制三组纳米接枝物的摩尔比,自组装形成具有双重敏感的胶束。胶束粒径均在110nm-150nm范围内,载药率为25%左右（wt%）。粒度分析仪测得胶束在pH7.4时粒径稳定,在pH5.0时4h之内完全解离。GPC测定酶敏感多肽AANL在不同条件下的断裂情况;HPLC测定CAD中酸敏感顺式乌头酸键在不同pH条件下的断裂情况。PEG5000在pH6.3情况下6h的释放率为45.3%,作为对比,在pH7.4情况下12h释放率低于20%;HPLC显示CAD中顺式乌头酸键在pH5.0时超过91.2%发生断裂;进一步研究胶束释药效率,在pH5.0时24h药物累积释放率为83.32%。体外生物学研究表明当EP-NPs在pH6.3时,对豆蛋白酶高表达的MDA-MB-231细胞的内摄效果较好,毒性较强（细胞存活率约为20%）,作为对比,豆蛋白酶低表达的L929细胞毒性低（细胞存活率约为50%）。体内抗肿瘤结果表明,EP-NPs的肿瘤抑制率达到约90%;给药28天内小鼠未死亡,证实EP-NPs具有较好的安全性。