论文部分内容阅读
目的：研究抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路中PI3K对乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)的作用及其对内分泌药物敏感性的影响；研究抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路中mTOR表达对曲妥珠单抗耐药的BCSCs的作用及对靶向治疗药物敏感性的影响。方法：1.采用无血清培养液悬浮培养球囊细胞的方法富集乳腺癌细胞系MCF-7中的BCSCs,使用流式仪分选出ESA+CD44+CD24-/low亚群,并对其进行克隆培养。构建表达芳香化酶CYP19的真核表达载体(pH β-Aro-CYP19),分别转染MCF-7中的BCSCs和非干细胞,从而获得高表达芳香化酶的BCSCs (BCSCs-CYP19)和非干细胞(MCF-7-CYP19)亚克隆。通过MTT检测细胞增殖、划痕实验评价细胞迁移能力、流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡、软琼脂克隆实验评价细胞克隆形成能力,比较单用PI3K靶向抑制剂BKM120及其联合内分泌治疗药物来曲唑对BCSCs-CYP19和MCF-7-CYP19的抑制作用的影响。利用Western blot检测单药BKM120或联合来曲唑用药对PI3K/Akt/mTOR通路中AKT1、PI3K、S6的蛋白表达水平的影响。2.通过使用不同浓度的曲妥珠单抗持续作用BT4746个月得到曲妥珠单抗耐药细胞BT474R,并通过MTT试验证实BT474R构建成功。采用无血清培养液悬浮培养球囊细胞的方法富集BT474和BT474R中的BCSCs,使用流式仪分选出ESA+CD44+CD24-low的BCSCs亚群,并对其进行克隆培养。利用VVestern Blot检测PI3K/Akt/mTOR通路中PI3K、AKT1、S6、mTOR蛋白表达水平的改变,评价该通路在曲妥珠单抗耐药过程中的作用影响。沉默BCSCs-BT474R中的mTOR,通过平板克隆实验检测细胞克隆形成能力；利用Western Blot检测下调mTOR表达后的BT474R干细胞中PI3K、AKT1、S6、mTOR蛋白表达水平的改变,评价下调：mTOR对BT474R-BCSCs的抑制作用。通讨MTT检测细胞增殖、平板克隆实验评价细胞克隆形成能力,比较单用联合nTOR抑制剂依维莫司和靶向治疗药物曲妥珠单抗对BT474R-BCSCs的抑制作用的影响。结果：1.BKM120对BCSCs-CYP19和MCF-7-CYP19的作用：与对照组相比,BKM120对MCF-7-CYP19及BCSCs-CYP19生长均具有抑制作用,抑制作用呈剂量依赖性。BKM120可降低BCSCs-CYP19的迁移能力、克隆形成能力和球囊形成能力。BKM120可显著降低BCSCs-CYP19中PI3K、AKT1、S6的蛋白表达水平。2.BKM120联合来曲唑对MCF-7-CYP19及BCSCs-CYP19的作用：联合应用BKM120与来曲唑可抑制BCSCs-CYP19的克隆形成能力, G0-G1期细胞滞留比例增加,可诱导细胞早期凋亡,下调BCSCs-CYP19中PI3K、AKT1、S6的蛋白表达。3. PI3K/Akt/mTOR通路在曲妥珠单抗耐药细胞中处于激活状态；沉默BT474R-BCSCs的mTOR, BT474R-BCSCs对曲妥珠单抗的抵抗作用降低,位于mTOR上游的蛋白的表达无显著变化,而mTOR表达及其下游的S6蛋白磷酸化显著降低。证实PI3K/Akt通路下游分子mTOR在曲妥珠单抗耐药中发挥重要作用。4. mTOR抑制剂依维莫司可有效抑制BT474R-BCSCs的生长和体外克隆形成能力,其联合曲妥珠单抗抑制BT474R-BCSCs生长的作用更强。结论：1.PI3K抑制剂BKM120可抑制内分泌治疗耐药的BCSCs, BKM120联合来曲唑较单药可更有效的抑制内分泌治疗耐药的BCSCs并下调PI3K/Akt/mTOR通路中重要下游产物的表达,在逆转内分泌治疗耐药的乳腺癌治疗中有潜在的应用价值。2. PI3K/Akt/mTOR通路在曲妥珠单抗耐药细胞中处于激活状态,沉默mTOR和应用mTOR抑制剂依维莫司可有效抑制曲妥珠单抗耐药乳腺癌细胞和BCSCs,在逆转曲妥珠单抗耐药的乳腺癌治疗中有潜在的应用价值。