论文部分内容阅读
前言:胎盘病态附着（Morbidly adherent placenta,MAP）是指胎盘异常附着于子宫的疾病,包括胎盘附着部位的异常如前置胎盘（placenta previa,PP）,以及胎盘附着深度的异常如胎盘植入（placenta accrete spectum,PAS）。胎盘植入是指蜕膜基底层部分或全部缺失导致胎盘绒毛异常植入子宫壁,是导致产后出血、子宫切除的主要原因,可以导致产妇和新生儿的各种不良结局。胎盘绒毛不仅可侵入子宫肌层,还可穿透子宫壁进入外浆膜层甚至膀胱,使胎盘不能从子宫中剥离。产前影像学超声检查为胎盘植入诊断的首选的重要检查方法。PPP发生植入的主要部位为子宫下段前次剖宫产瘢痕周围,主要特征是胎盘的穿透性生长及胎盘血管高度的血管化。三维能量多普勒超声敏感性及阳性预测值高,可准确评估子宫下段异常血管血流情况。产前超声评估胎盘植入程度及凶险程度,做好充分术前准备,可减少术中出血及严重并发症。胎盘植入形成的分子基础尚未阐明,但可能涉及母体蜕膜和滋养层组织之间异常的蛋白表达及信号转导。以疾病组织为实验材料的蛋白组学研究,因其能真实反映机体内环境的情况,不仅可以为疾病的早期诊断提供新的特异性候选标志物,还为认识发病机制提供线索。锌指E盒结合蛋白（Zinc finger E-box-binding protein,Zeb）在细胞分化和胚胎发育中起着重要作用。据报道,Zeb1与肿瘤侵袭、转移及血管形成等生物学过程密切相关。尽管胚胎植入子宫内膜与肿瘤的侵袭机制相似,但对胎盘植入中Zeb1的研究却很少。目的:探寻凶险性前置胎盘胎盘植入蛋白质组学差异蛋白的情况;探讨Zeb1在胎盘植入的胎盘组织中的表达情况,以及Zeb1对HTR-8/SVneo和HUVECs细胞的细胞生物学功能的影响。研究方法:第一部分选取2015年11月-2017年11月于我院诊断并分娩的凶险性前置胎盘患者150例,术前72小时内进行产前超声检查（二维+三维彩色多普勒+三维能量多普勒）,留取母血及胎盘组织标本。回顾性分析三维能量多普勒超声VI、FI及VFI在不同植入程度的凶险性前置胎盘中的差异,分析三维能量多普勒超声评分在预测凶险性前置胎盘胎植入及凶险程度中的应用。采用蛋白定量DIA技术,高通量、高效率地鉴定及筛选凶险性前置胎盘胎盘植入及VFI>20的差异蛋白表达。第二部分研究Zeb1在胎盘植入的胎盘组织中的表达。实验分组:（1）植入组:凶险性前置胎盘患者术前超声VFI>20且术后病理诊断胎盘植入的20例胎盘植入部位胎盘组织;（2）未植入组:凶险性前置胎盘患者术前超声VFI<10且术中无胎盘粘连植入的20例胎盘组织;（3）正常对照组:单胎、一次剖宫产术后再次妊娠妊娠晚期经剖宫产终止妊娠的20例患者胎盘组织。实验方法:通过免疫组化染色方法分析Zeb1、VEGF和E-cad在三组胎盘组织中表达情况;western blot实验和real-time PCR方法分析Zeb1、E-cad、N-cad、VEGF在三组胎盘组织中表达情况。第三部分细胞实验选取HTR-8/SVneo人绒毛膜滋养层细胞作为研究对象,在细胞中分别过度表达和沉默表达Zeb1,通过MTT、流式细胞技术以及AV-PI染色技术分析Zeb1对HTR-8/SVneo人绒毛膜滋养层细胞增殖和凋亡的影响。选取HTR-8/SVneo人绒毛膜滋养层细胞作为研究对象,在细胞中分别过度表达和沉默表达Zeb1,通过transwell技术分析Zeb1对HTR-8/SVneo人绒毛膜滋养层细胞迁移能力的影响。通过western blot和real-time PCR实验分别检测Zeb1对HTR-8/SVneo人绒毛膜滋养层细胞中Zeb1、E-cad、N-cad、VEGF、Cyclin D1和bcl-2的蛋白含量与RNA含量。选取HUVECs人脐静脉内皮细胞作为研究对象,在细胞中分别过度表达和沉默表达Zeb1,通过MTT、流式细胞技术以及AV-PI染色技术分析Zeb1对HUVECs人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响。选取HUVECs人脐静脉内皮细胞作为研究对象,在细胞中分别过度表达和沉默表达Zeb1,通过transwell技术分析Zeb1对HUVECs人脐静脉内皮细胞迁移能力的影响。通过western blot和real-time PCR实验分别检测Zeb1对HUVECs人脐静脉内皮细胞中Zeb1、E-cad、N-cad、VEGF、Cyclin D1和bcl-2的蛋白含量与RNA含量。在沉默Zeb1后的HTR-8/SVneo和HUVECs细胞中添加Akt激活剂（IGF1）,随后通过western blot和real-time PCR实验分别检测Zeb1对Zeb1、Akt、Aktp-Ser473、Aktp-Tyr308、E-cad、N-cad、VEGF、Cyclin D1和bcl-2的蛋白含量与RNA含量。数据表示方式为平均值±标准差,并用SPSS软件进行数据分析。通过单因素方差分析（ANOVA）和Turkey’s多重比较试验计算组间平均值的差异,P<0.05设定为有统计学意义。结果:1.三维能量多普勒超声中的VFI作为量化指标评估凶险性前置胎盘胎盘植入程度,VFI<10,预测无明显胎盘植入,VFI>20提示胎盘植入及穿透性植入可能性大;2.160个蛋白的表达水平在凶险性前置胎盘伴植入与未植入存之间在差异,38个蛋白表达上调,122个蛋白表达下调,为凶险性前置胎盘胎盘植入的预测及相关研究提供基础;3.Zeb1、N-cad和VEGF在凶险胎盘植入组中表达最高,在正常对照组中表达最低。E-cad在凶险胎盘植入组中表达最低,在正常对照组中表达最高;4.Zeb1具有促进HTR-8/SVneo和HUVECs细胞增殖、细胞迁移,抑制细胞凋亡的作用;5.western blot与real-time PCR实验显示与对照组比较,Zeb1过表达可以上调Zeb1、N-cad、VEGF和bcl-2的含量,下调E-cad的表达;Zeb1低表达可以下调Zeb1、N-cad、VEGF和bcl-2的含量,上调E-cad的表达。结论:1.三维能量多普勒超声可预测凶险性前置胎盘胎盘植入及凶险程度;2.Zeb1在凶险性前置胎盘胎盘植入形成中发挥作用;3.Zeb1有调节HTR-8/SVneo和HUVECs细胞增殖、凋亡和迁移的作用。