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苦瓜(MomordicacharantiaL.)系葫芦科草本植物,富含多种营养成分,作为一种传统的蔬菜和中药,具有药膳同源之功效。其子衣色素可以作为一种天然食用色素,广泛应用于食品、日化、医药等行业。不仅可作为添加剂为食品着色,有的品种由于保留了植物体内的多种天然活性物质,如维生素、氨基酸、核苷酸、小分子活性肽、芳香物质及某些必需元素等,还兼有营养保健功能。本试验以不同成熟度苦瓜子衣为材料,应用硫酸铵沉淀法和双水相提取法均得到苦瓜色素蛋白;经过DEAE-52阴离子层析、SephadexG-100凝胶柱层析进一步分离纯化苦瓜色素蛋白;同时运用生化-分子生物学技术研究纯化苦瓜色素蛋白的生物学特性及抗氧化性。主要试验结果有:
1.通过紫外可见吸收光谱图可以得出苦瓜色素的最大吸收波长为474nm,由正交试验可以确定苦瓜子衣色素提取的最佳条件为:温度50℃,料液比为1/40g/ml,时间为30min时苦瓜色素的提取率最高为45.54%。
2.纯化苦瓜子衣色素具有较好的稳定性。但是高温、强光照、在偏酸或偏碱的环境、氧化剂还原剂的存在,以及高浓度的金属离子都会对苦瓜子衣色素的稳定性构成威胁,因此提取时要尽量避免。
3.通过薄层层析可以得出苦瓜子衣色素中有至少有两种比较多的色素:β-胡萝卜素和番茄红素。
4.40%、40%-80%硫酸铵分级制备蛋白SDS-PAGE凝胶电泳结果显示:40%硫酸铵沉淀蛋白主要含有一种,分子量约为20kD;即没有差异条带。而40%-80%硫酸铵出多种蛋白质并且包含差异条带。用双水相法提取的各阶段的蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳,二者均用凝胶处理软件BandScan5.0对图像进行处理,结果均发现目的条带。
5.40%-80%硫酸铵沉淀的蛋白上DEAE纤维素柱,得到两个吸收峰,再过SephadexG-100柱进一步纯化得到目的蛋白,SDS-PAGE电泳图片显示:纯化苦瓜色素蛋白的分子量为74.1kD,等电点为7.2,存在链间二硫键。
6.纯化苦瓜色素蛋白和40%-80%硫酸铵沉淀蛋白清除羟自由基的能力相差不大。都是随着质量浓度的增加抗氧化性增强,但是,前者在同等的质量浓度下均稍弱于后者。二者均不及抗坏血酸的抗氧化性。
本研究确立了苦瓜色素的最佳提取条件,对子衣色素进行了的定性分析以及对色素稳定性进行了探究,分离纯化出与色素形成相关联的色素蛋白,并得出了其生物学特性,和抗氧化性的效果,因此色素形成与色素蛋白存在密切相关,色素蛋白在色素形成中的作用机理有待探讨,以期为其在食品科学和生命科学领域的应用提供新的线索和依据。