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目的: 1.研究肺炎克雷伯菌质粒的分子进化及存在的基因水平转移现象; 2.分析肺炎克雷伯菌质粒中携带的mmuM基因并探索其散播方式; 3.初步研究肺炎克雷伯菌多质粒共存的质粒相容性。 方法: 1.获取肺炎克雷伯菌pKF3-70、pKF3-94和pKF3-140质粒的完整基因组序列;对三个质粒分别按统一标准重新进行ORF预测及功能注释,并基本确定pKF3-94质粒的基因组结构。 2.收集数据库中的全部质粒基因组序列,鉴定质粒中的同源基因并构建质粒的基因内容树,进行质粒的进化分析。 3.利用plasmidRST系统,对pKF3-70、pKF3-94和pKF3-140质粒的复制子进行鉴定,初步研究质粒的相容性现象。 4.检索、筛选并获取数据库中全部mmuM基因的核苷酸序列,通过聚类分析和进化分析研究mmuM基因的变异情况。 5.通过与本室的高通量测序数据集进行mapping,进一步分析mmuM因在九种临床致病菌中的分布情况及序列保守性,并通过PCR实验及测序手段进行验证。 6.利用BLAST、Mauve等工具,对pKF3-94和pKF3-140质粒与相关质粒和染色体基因组进行比较基因组分析。 结果: 1.pKF3-94质粒基因组结构中的分区较为明显:骨架(保守)区域和可变区域,其中保守区域包括了结合转移区域和转移引导区域;可变区域主要包括可移动DNA元件、耐药基因和复制子等功能区域。 2.质粒进化分析结果显示,pKF3-94质粒与pK1HV及pC15-k质粒的系统发育关系更为相近,而与同菌株中的pKF3-70和pKF3-140质粒相距较远。 3.pKF3-94与pC15-k、pK1HV质粒除具有相同的骨架区域外,还与pC15-k质粒共有一段长15 kb的同源区域,该区域包含有两个耐药基因和一个复制子;而pK1HV质粒含有一段独特的49 kb区域,其富含多个可移动元件和耐药基因。 4.pKF3-94质粒是一个含有两个不同的复制子类型的多复制子质粒,它们与pKF3-70和pKF3-140中的复制子具有较大的差异。 5.mmuM基因广泛分布于各种细菌,且相互间差异较大;不同菌属中的mmuM基因的保守性不同;进化分析显示,部分来自不同菌属中的mmuM基因间的系统发育关系比来自相同菌属的更加接近。 6.与高通量测序数据集进行mapping的结果显示mmuM基因在七种临床致病菌中都有存在;PCR实验及测序也进一步证实了mapping的结果。 7.pKF3-140质粒与pIP1206质粒共有一段长21kb的同源区域,该区域中的4.9 kb片段与大肠杆菌基因组中的相应区域较为一致,该片段包含一个由mmuM基因及转座酶和插入序列组成的转座子结构。 结论: 1.pK1HV和pC15-k质粒的骨架区域可能都起源于一个pKF3-94样的质粒,而可变区域通过基因水平转移来自其他不同的基因组中。 2.mmuM基因在不同种属细菌的质粒与质粒之间或质粒与染色体基因组间进行转移与重组。 3.高通量测序与比较基因组分析相结合的方法揭示了基因水平转移在质粒基因组进化和耐药基因的迅速散播过程中起到重要的作用。 4.研究质粒复制子结构和差异,有助于我们进一步解释质粒的相容性现象。