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胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中,作为消化酶而起作用,它是肽链内切酶,能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。胰蛋白酶是特异性最强的蛋白酶之一,是决定蛋白质的氨基酸排列的不可或缺的工具。目前,胰蛋白酶主要有两种来源,第一种是从动物（猪、牛等）的胰脏中提取得来的,工艺复杂且价格昂贵,较大程度上限制了胰蛋白酶的应用。第二种是使用基因工程重组技术获得产重组胰蛋白酶的微生物表达系统,经过发酵表达再进行纯化提取。本文采用第二种方法,利用基因工程毕赤酵母菌（P.pastoris）进行高密度发酵工艺高效表达重组胰蛋白酶原。结果表明,胰蛋白酶原的生产水平较高,且激活的胰蛋白酶的酶切特异性与动物胰腺来源的胰蛋白酶相同。相比动物胰腺提取的胰蛋白酶,重组胰蛋白酶具有无外源性病毒污染,不存在其它杂酶的污染,酶切反应的特异性较高,不存在其它副反应等优势。本文旨在探讨重组胰蛋白酶原在P.pastoris中的表达,并实质性地进行了工业化生产及应用。本文通过分子克隆获得胰蛋白酶原基因（参照欧洲专利EP1399568B1）构建重组表达质粒,重组表达质粒经过电转化进入宿主GS115中进行诱导表达,经表达筛选后获得胰蛋白酶原高产重组工程菌,菌株命名为P.pastoris GS115/pPIC9K-Bd P4 WB54。其次,本文对该工程菌的形态、生化特征和遗传特征进行了研究,并建立了该菌株的主细胞库（Master Cell Bank,MCB）和工作细胞库（Working Cell Bank,WCB）。通过对该细胞库的传代稳定性进行了全面的考察,以确定该细胞库能够稳定传代并持续表达目标蛋白。试验结果表明,该重组胰蛋白酶原工程菌具有典型的P.pastoris形态和生化特征,且目的基因准确整合到宿主细胞基因组上;经过传代30次后,该工程菌传代稳定,这说明重组基因稳定并能持续稳定地表达目标蛋白。再次,本试验对获得的工程菌株的发酵工艺在50 L试验规模上进行了优化,包括:接种时间、接种量、培养基、诱导菌体浓度、诱导pH、诱导温度、甲醇补加速率、有机氮源补加量、尿素补加速率和发酵周期等。结果在优化后的工艺条件下,取得7.5 g/L的重组胰蛋白酶原表达水平,具体的优化条件如下:最佳接种时间为（2124 h）*(OD600=1931)、最佳接种量为5%（v/v）、最佳培养基为BGJZ培养基（配方:85%H3PO413 m L/L、甘油40 g/L、CaSO4·2H2O 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 7 g/L、KOH 2 g/L、PTM1溶液4.35 mL/L、尿素6 g/L和GPE消泡剂2 m L/L）、最佳诱导菌体浓度为OD600为170±5、最佳诱导pH:4.0、最佳培养温度为25℃;最佳甲醇补加速率为7.0 g/L/h;最佳有机氮源（YEB培养基:1%酵母粉和2%大豆蛋白胨）补加速率为2.0 g/L/h、最佳尿素补加量为2.0%、最佳放罐时间为110 h。最后,本文将获得的重组P.pastoris和最佳发酵工艺放大到了5000 L的生产规模。试验结果表明,重组获得的工程菌和优化后的发酵工艺可顺利放大,各项工艺参数均与50 L规模的一致,且菌体浓度和重组胰蛋白酶原表达量也能达到小试水平,重组胰蛋白酶原表达量达到7.5 g/L的水平。本文成功地构建了一株可用于生产重组胰蛋白酶原的工程P.pastoris,并对该工程菌的发酵工艺条件进行了研究,最终获得了较高的胰蛋白酶原表达量,并实质性地进行了工业化生产及应用。