论文部分内容阅读
污染微生物的各种代谢产物，多能造成啤酒异味、混浊和沉淀，严重影响啤酒的质量。目前，国内对啤酒中腐败微生物鉴定的传统方法都不同程度地存在试验周期长、准确性不高、自动化程度低等不利因素。PCR技术为检测啤酒杂菌提供了快捷、灵敏、准确的方法，可在短期内对污染菌进行检测。 我们用玻璃珠法、溶菌酶法、冻融法、氯化苄法（phCH2Cl）对啤酒发酵液混合菌、生产用啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、K氏酵母、啤酒生产污染菌（细菌T、W、Y）、G-细菌、G+细菌的基因组DNA进行提取，通过对不同方法裂解细胞效率的比较、DNA浓度测定、电泳检测和RAPD-PCR扩增进行分子识别和检测技术研究。结果表明，溶菌酶法和冻融法对细菌的裂解率为99％-100％，对酵母的裂解率只有15％-28％；玻璃珠法对酵母的裂解率为92％-94％；phCH2Cl法对细菌和酵母的裂解率均为100％。提取啤酒发酵液混合菌基因组DNA，浓度测定结果分别为：玻璃珠法15.4μg／mL、溶菌酶法18.0μg／mL、phCH2Cl法40.7μg／mL。电泳检测结果表明，4种方法得到的混合菌DNA均大于23kb，无拖尾、无蛋白污染。phCH2Cl法图谱更清晰，DNA得率29.94μg／mg湿菌体。RAPD-PCR扩增结果表明，溶菌酶法和phCH2Cl法所提DNA的PCR图谱清晰，重复性好。 用76条随机引物对S．cerevisiae基因组DNA进行RAPD-PCR扩增，凝胶电泳检测，结果表明，16条引物没有扩增产物，60条引物有扩增产物，且每条引物扩增效果存在差异。通过比较，根据图谱清晰、条带数量适中、主带明显的原则，初步筛选出16条引物。用选出的16条随机引物对12株不同菌株（10株酵母菌，2株细菌）基因组DNA进行RAPD-PCR扩增，结果表明，大部分引物都有扩增产物。通过比较，根据图谱条带差异程度大、具有特征性主带的标准，进一步筛选出4条引物，用于鉴别不同的酵母菌和细菌。 W与S．cerevisiae各有其独特稳定的RAPD-PCR指纹图谱，混合菌的图谱为两菌图谱的叠加。用引物S106进行PCR，W在771bp处有一条非常亮的带，S．cerevisiae在该位置没有条带。两菌按一定比例混合，提取基因组DNA，PCR检测混合菌体系中W检出灵敏度，结果表明，W占混合菌菌量的0.1％时，可被RAPD-PCR方法所检测。酒精酵母（As2.399）与S．cerevisiae的混合菌体系也得到相同的结论，表明RAPD-PCR在混合菌体系中的检出灵敏度可达到0.1％。 由此可见，RAPD-PCR能够很好的区分啤酒发酵培养酵母、非培养酵母和细菌，所以能够用于啤酒发酵过程中微生物的动态检测。