研究背景和目的：“脾主涎”,涎,即唾液。柠檬酸刺激前后唾液淀粉酶(sal ivary alpha amylase, sAA)活性比值下降作为脾虚证诊断客观参考指标已较得到公认,有研究显示,成人脾虚证存在自主神经功能紊乱,且其酸刺激后sAA活性低下与唾液总糖蛋白及sAA的N-糖基化不完全有关,另外,有学者发现脾虚证患者存在多个参与N-聚糖合成的糖基转移酶基因表达异常。以上研究多以成人脾虚证患者为对象,而对于发病或处于亚健康状态儿童,脾虚证作为主证或兼夹证,在中医证型分布中占有较高的比例,但目前尚少见有脾虚证儿童sAA活性比值的研究资料发表。现代研究表明,sAA,活性主要受sAA基因(AMY1)拷贝数、蛋白含量及其N-糖基化修饰影响,且sAA蛋白N-糖基化修饰及分泌主要受交感神经调控。本文研究脾虚证儿童柠檬酸刺激前后sAA活性比值变化,以及AMY1拷贝数、sAA蛋白含量、N-糖基化和非糖基化sAA含量改变,旨在为脾虚证儿童采用酸刺激前后sAA活性比值作为临床诊断参考指标提供科学依据,并探讨sAA,活性比值下降与AMY1表达及sAA,的N-糖基化修饰是否有关联。“脾在味为甘”,甘即甜味,临床上看到部分脾功能失调者出现口中甘味。近有研究表明,甜味觉可以诱导胰岛素头相反应(cephalic phase insulin release, CPIR),与人类糖代谢关系密切；甜味觉还可以激活大脑多巴胺能、5-羟色胺能和内源性肽能神经系统,进而影响食欲。另外,古代与现代均认识到脾与糖脂代谢有密切联系。根据“脾在味为甘”以及脾与代谢病发病的相关论述,本文选用甜味受体基因差异小鼠进行甜味觉刺激实验,观察小鼠机体糖代谢反应情况,初步探讨从甜味觉受体角度研究脾虚证的可能性。研究方法：1.脾虚证儿童柠檬酸刺激前后唾液分泌变化研究1.1柠檬酸刺激采集唾液方法学考察目前,sAA活性比值实验中柠檬酸刺激采集唾液的方法并不规范,如酸刺激强度没有明确的界定、酸刺激开始后唾液的采集也没有统一的标准等。成人相比于儿童具有更好的顺应性,利于考察柠檬酸刺激采集唾液方法学。2012年10月于广州中医药大学校园以广告形式募集9例健康成人志愿者(女性5例、男性4例),平均年龄25.2±1.1岁(24-27岁)。统一唾液采集前准备及采集时的体位,利用5种不同规格的柠檬酸滤纸,分别为0.2M/0.5×(0.2M代表柠檬酸浓度为0.2mmol/L,0.5×代表柠檬酸滤纸面积为0.5 cm×0.5 cm)、0.2M/1×、0.2M/2×、0.1M/1×和0.4M/1×,以定时的方法对每一位志愿者分别采集刺激前2 min、刺激时1 min和刺激后2 min唾液,测定sAA活性和唾液流率,考察不同浓度和面积的柠檬酸滤纸对sAA活性比值和唾液流率的影响(酸刺激时sAA活性比值=刺激时sAA活性／刺激前sAA活性,酸刺激后sAA活性比值=刺激后sAA活性／刺激前sAA活性)。1.2从唾液中提取基因组DNA方法学考察1.2.1碘化钾法与试剂盒法比较比较碘化钾法与标准商业试剂盒法对新鲜和室温保存一周唾液中(即口腔黏膜脱落细胞)提取基因组DNA方法学,初步验证碘化钾法可靠性及稳定性,为后续儿童基因组DNA提取及AMY1基因拷贝数测定提供参考依据。2013年3月于广东药学院校园以广告形式募集6例健康成人志愿者,分别利用碘化钾法和口腔拭子基因组DNA提取试剂盒法,提取新鲜和室温保存一周的唾液基因组DNA。DNA提取后,1%的琼脂糖凝胶电泳,并测定DNA含量(即得率)和纯度(D260/D280、D260/D230);接着,以提取的唾液基因组DNA样品作为模板,PCR扩增肿瘤蛋白TP53基因和唾液特异蛋白PRB-3基因,PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。1.2.2扩大样本验证碘化钾法碘化钾法为课题组参考文献改进而来,本研究进一步扩大样本验证该法的可靠性及稳定性。2013年3月至11月,以广告形式从广州市海珠区妇幼保健院和广东药学院校园分别募集47名健康儿童和52名健康成人,采集唾液标本后-80℃保存,并在一星期内以碘化钾法提取基因组DNA。DNA提取后,DNA含量和纯度测定以及体外PCR扩增验证如上述；另外,为了探讨唾液中微生物和食物残渣是否会干扰PCR扩增,本研究还对碘化钾法提取的基于因组DNA进行了TP53基因荧光实时定量PCR扩增。1.3病例选择及分组对照设计1.3.1脾虚证和健康儿童选择中医辨证标准、病例纳入及排除标准：1、中医辨证标准：儿童脾虚证辨证标准参考中国中西医结合研究会儿科专业委员会第二届学术会议制定草案(1999年,厦门)修改。主要指标：(1)食欲不振；(2)大便失调(包括泄泻,大便虽成形,次数增多或大便难解)；(3)面色萎黄少华；(4)形体消瘦(体重低于正常同龄同性别平均值10%)；(5)舌质淡,苔薄白。次要指标：(1)肢倦乏力；(2)腹胀；(3)轻度浮肿；(4)轻度贫血；(5)口流清涎；(6)睡时露睛或多汗；(7)脉细弱、无力、指纹淡(3岁以下)。判断：凡符合主要指标4项或主要指标2项加次要指标1项均可诊断脾虚证。2、脾虚证儿童纳入标准：年龄5-12岁儿童,符合上述儿童脾虚证辨证标准。3、排除标准：(1)心、脑、肝、肾和造血系统等原发性疾病；(2)过敏体质、感染性疾病发病期、精神性疾病；(3)近1个月有使用哮喘、风湿、止痛及精神类药物者。4、健康儿童纳入标准：年龄5-12岁,无明显的西医诊断疾病,中医辨证阴阳平和者。1.3.2消瘦和健康儿童选择考察消瘦儿童柠檬酸刺激前后sAA活性变化分子机制对探讨儿童脾虚证本质有一定参考价值。在上述收集的全部脾虚证和健康对照儿童病例中,经过测量身高(cm)和体重(kg)后,根据6个大型国际流行病学调查界定的标准,以体重指数(body mass index, BMI)将其分为低BMI(消瘦)和正常BMI(健康)儿童；另外,根据中国肥胖工作组设立的标准排除超重或肥胖儿童。1.4唾液采集与指标测定1.4.1唾液采集儿童唾液采集方法和流程基于本实验前述成人唾液采集方法学考察结果进行改进。儿童受试者先静坐10 min,充分休息,采取坐位、头稍前倾、眼睛睁开的体位,然后通过吞咽的方法将口腔唾液排净后,让唾液在口腔汇聚3 min后一次性自然流出,获得刺激前唾液；紧接着,用含0.4 mol/L柠檬酸、大小为1 cm×1 cm的滤纸,刺激舌尖1 min,然后快速一次性收集柠檬酸刺激后唾液。在酸刺激期间,嘱受试者将舌尖抬起以避免柠檬酸进入唾液,影响唾液pH值。1.4.2唾液指标测定唾液流率、pH值及总蛋白测定：唾液流率即为唾液体积(mL)与收集耗时(min)的比值(mL/min);pH精密试纸测定唾液pH值；BCA蛋白测定试剂盒测定唾液总蛋白含量(mg/mL)。sAA活性测定：利用国际临床化学和实验室医学联盟(IFCC)所推荐的EPS-G7速率法,来测定sAA活性(U/mL)。sAA比活(U/mg)=sAA活性(U/mL)/总蛋白含量(mg/mL)。sAA含量测定：通过引进已知含量的人源sAA标准品,利用Western blot (WB)的方法测定柠檬酸刺激前后唾液样品中糖基化、非糖基化及总sAA的含量(mg/mL)。sAA糖基化水平即糖基化sAA含量占总sAA含量的比例。AMY1基因拷贝数测定：根据本实验前述从唾液中提取基因组DNA方法学考察结果,利用碘化钾法提取儿童唾液基因组DNA后,对AMY1基因和肿瘤蛋白TP53基因(内参基因)进行荧光定量PCR扩增。通过引进已知含14个AMY1基因拷贝数的DNA标准品,以2“△Ct*14的方法算出待测DNA样品AMY1基因拷贝数。1.5统计分析采用GraphPad Prism 5.0进行作图并统计学分析,计量资料以X±SD表示,刺激前后唾液指标组内比较进行配对t检验,组间比较采用两独立样本t检验,两组数据相关性分析用Pearson相关系数。P<O.05为差异有统计学意义。2.小鼠甜味觉差异与代谢及食欲等生理与行为学指标相关性研究2.1动物伦理、模型及分组伦理：所有动物实验经过宾夕法尼亚大学附属莫奈尔中心相关伦理委员会审查通过,实验过程中实验人员尽最大努力减少动物痛苦。模型：选择同窝雌雄129.B6-Taslr3同源异基因小鼠,代数为N17F9,由莫奈尔中心Dr. Bachmanov实验室培育。该系小鼠是利用129P3/J(129)和C57BL/6ByJ(B6)小鼠杂交后产生F1代,接着F1杂合后代F2再与129回交超过10次培育而成。经TaqMan的SNP基因座鉴定分析方法鉴定,该系小鼠含两种基因型,分别是129/B6-Taslr3杂合小鼠(简写：B6/129)和129/129-Taslr3纯合小鼠(简写：129/129)。杂合小鼠即B6/129除4号染色体有一小段来自B6外,其他与129完全一致,该段染色体含数个基因,而Taslr3被证实是唯一影响小鼠甜味觉的基因,故两种基因型小鼠甜味觉有显著差异,而其他一般生物学特性,如外貌、习性及解剖学等特点并无明显差异。分组：以129/129纯合小鼠为对照组,以含外源性基因的B6/129杂合小鼠为实验组,两组小鼠数量在12只到29只不等。2.2实验条件动物实验在美国宾夕法尼亚大学附属莫奈尔中心Dr. Bachmanov实验室进行,实验在温度为23℃以及12：12小时的光暗周期(上午7：00灯光自动打开直至晚上7：00熄灯)环境中进行。实验开始前,新生的性别相同的同窝小鼠饲养于同一小鼠盒子,每个盒子小鼠数量在1至6只之间不等数量,饲养至二月大(2-mo)；开始实验后(2-mo),将同盒的雄性小鼠分开,单独饲养于独立的盒子,而雌性小鼠继续饲养于同盒,直至完成全部实验。另外,小鼠饲料为Teklad Rodent Diet 8604,该饲料含70%左右的淀粉类食物(如玉米淀粉),饮用水为莫奈尔中心提供的去离子水。2.3实验项目2.3.1糖精喜好实验本实验可以确认两组小鼠的甜味觉差异,为后续研究甜味觉差异对小鼠生理与行为学影响作铺垫。在2-mo至6-mo之间,采用经典的two-bottle test,测量两组小鼠对2 mM和10 mM糖精溶液的喜好程度及摄入量,每个浓度糖精溶液测量96小时(去离子水作为第二选择)。糖精和水的每日摄入量用每30 g小鼠体重表示(mL/30g BW)或以相对百分比表示(%,糖精或水的摄入量／总液体摄入量)。2.3.2糖耐量和胰岛素耐量实验甜味觉差异会引起糖代谢的变化,本实验可以考察两组小鼠糖代谢情况。当小鼠2-mmo大时,每只小鼠首先接受腹腔注射的糖耐量实验(IP GTT),接着是灌胃注射糖耐量实验(IG GTT),然后是胰岛素耐量实验(ITT),各实验间隔一周左右以洗脱实验间相互影响；当小鼠6-mmo大时,进行同样的实验。2.3.3 LabMaster分析实验甜味觉差异可以引起食欲变化,本实验可以分析两组小鼠多个生理与行为学指标(含食欲)。分别在2-mo和6-mo对小鼠进行核磁共振(见下述)分析后约一周,利用LabMaster系统对小鼠的能量代谢、活动量、进食及饮水量等进行测量。该系统每隔30 min对小鼠的吸入氧气量(VO2)、呼出二氧化碳量(VCO2)、呼吸交换率(respiratory exchange ratio, RER)、能量消耗(energy expenditure, EE)、水平和垂直活动量以及饮水和进食量进行测量记录,连续记录5天。其中,RER和EE可以考察小鼠能量代谢情况。实验结束后,数据进行平均化处理,得到24小时(一个昼夜周期)的平均数据进行展示。2.3.4体重曲线和身体成分构成分析实验糖代谢、食欲及能量代谢等差异影响小鼠身体成分构成,分析小鼠体重曲线及身体成分构成有助于深入分析小鼠甜味觉差异的生理病理影响,如脂代谢。体重曲线：小鼠体重分别在2-mo、3-mo、4-mo、5-mo和6-mo时于上午10：00左右进行测量,精确到0.1 g,实验结束后绘制体重曲线。核磁共振(NMR)：在小鼠分别完成2-mo和6-mmo的ITT后第二天,利用Bruker Minispec LF 110对小鼠进行扫描,分析身体成分构成；双能X线吸收测量法(DEXA):在6-mo的LabMaster分析实验后约一周,用吸入C02法将小鼠安乐死,利用Lunar PIXImus Ⅱ densitometer的双能X线吸收测量法对小鼠身体成分进行分析；解剖：对小鼠进行DEXA后,解剖脂肪组织和内脏器官并称重。2.4统计分析采用Statistica (version 10)统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(X±SD)或均数±标准误(X±SE)表示,采用ANOVA或GLM对数据进行分析,比较采用post hoc (Fisher LSD test),作图采用Excel或Statistica, P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.不同浓度和面积柠檬酸刺激对健康成人唾液分泌的影响同一柠檬酸浓度下(0.2M),与面积为0.5×的滤纸比较,面积为1×和2×的滤纸刺激时和刺激后sAA活性比值均显著提高(P<0.05),而以2×提高更明显；并且,除0.5×外,1×和2×刺激时和刺激后sAA活性比值均高于1(即酸刺激下sAA活性升高),且刺激后sAA活性比值均显著高于自身刺激时(P<0.05)。另外,与0.5×和1×比较,2×刺激下唾液流率增加较为明显。同一滤纸面积下(1×),不同浓度柠檬酸(0.1M、0.2M和0.4M)刺激下均能显著提高sAA活性,但与0.1M或0.2M比较,0.4M刺激时和刺激后sAA活性比值均显著提高(P<0.05)；并且,除0.1M外,0.2M和0.4M刺激后sAA活性比值高于自身刺激时(P<0.05)。另外,与0.1M和0.2M比较,0.4M刺激下唾液流率增加较为明显。研究结果提示,0.2M/2×或0.4M/1×柠檬酸滤纸可以显著增加成人唾液的分泌和sAA活性,且刺激后sAA活性比值明显高于刺激时。2.不同保存条件和提取方法对从唾液中提取基因组DNA的影响2.1碘化钾法与试剂盒法提取新鲜和室温保存唾液DNA的比较2.1.1基因组DNA的得率和纯度从DNA提取的得率(u g)来看,试剂盒法提取新鲜唾液标本获得的DNA含量最高(2.64±0.34),显著高于碘化钾法(P<0.05),而试剂盒法提取室温保存一周的唾液标本获得的DNA含量最低(0.51±0.11),显著低于碘化钾法(P<0.05)；碘化钾法对两种不同保存方法获得的DNA含量居中,且差异不大。从提取纯度(质量)来看,碘化钾法对新鲜唾液标本提取的DNA的D260/D280值为2.0左右(1.99±0.05),而且对室温保存样本获得DNA的D280/D280值更高(2.20±0.05),而试剂盒法对两种保存方法获得的DNA的D260/D280值都在1.8左右,均显著低于碘化钾法(P<0.05)；另外,碘化钾法提取的DNA的D260/D230值都明显低于试剂盒法(P<0.05)。研究结果提示,碘化钾法对两种不同保存条件下唾液DNA的得率比较稳定,但可能也存在少量RNA和盐离子、糖类物质的残留。2.1.2基因组DNA电泳结果两种方法对新鲜唾液样本提取的DNA在23 kb附近都有一条明显的主带,但是试剂盒法获得的DNA拖尾现象明显,提示DNA存在的降解；两种方法对于室温放置7天的唾液标本提取的DNA,都存在一定程度的降解,尤其是试剂盒法获得DNA样品降解严重,其中一个标本几乎没有明显的主带。结果提示碘化钾法对提取两种不同保存条件下唾液DNA的降解程度较轻。2.1.3基因组DNA体外PCR扩增两种不同提取方法和保存条件下得到的DNA样品对TP53(192 bp)和PRB-3(1261bp)基因都有非常好的PCR扩增效果,PCR产物大小与预期一致。2.2碘化钾法提取-80℃冻存唾液DNA考察碘化钾法对-80℃冻存唾液标本提取的基因组DNA的得率、纯度以及电泳结果都与碘化钾法提取新鲜唾液标本的结果一致,无明显差异；另外,其DNA样品对TP53和PRB-3基因也都有非常好的PCR扩增效果。此外,荧光定量PCR结果显示,TP53基因有很好的荧光扩增曲线,并且荧光融解曲线只有一个特征峰,提示唾液中微生物和食物残渣不会干扰人源基因组DNA的PCR扩增。研究结果提示,相对于商业试剂盒法,碘化钾法可以快速稳定地从不同保存条件下的唾液中提取足量和高质量的DNA。3.脾虚证儿童酸刺激前后唾液指标变化3.1一般资料在2013年4月至11月,于广州市海珠区妇幼保健院中医科,共收集20例脾虚证儿童及29例健康对照组儿童。脾虚证儿童中,男10例、女10例,平均年龄8±2岁；健康对照组儿童中,男15例、女14例,平均年龄7±3岁,两组儿童的年龄和性别构成无明显差异(P>0.05)。所有参与本研究儿童的父母或监护人签署知情同意书。3.2脾虚证儿童与健康儿童酸刺激前后唾液指标组内比较健康儿童组酸刺激前后比较,酸刺激后sAA活性、sAA含量、糖基化sAA含量及非糖基化sAA含量相对于酸刺激前明显提高(P均<0.05)；另外,唾液流率及pH值也显著提高(P<0.05),研究提示健康儿童唾液分泌对柠檬酸刺激反应良好。脾虚证儿童组酸刺激前后比较,酸刺激后只有唾液流率、pH值及sAA糖基化水平显著提高(P<0.05),其余指标如sAA活性等均无明显提高,提示脾虚证儿童酸负荷下唾液分泌反应减弱。3.3脾虚证儿童与健康儿童酸刺激前后唾液指标组间比较脾虚证儿童酸负荷下sAA活性比值(1.87±1.04)相对于健康儿童(2.72±1.58)明显降低(P<0.05),提示酸负荷下脾虚证儿童sAA活性增加的幅度明显低于健康儿童,与文献报道成人脾虚证研究结果类同。脾虚证儿童sAA糖基化水平比值(1.54±0.63)相对于健康儿童(1.20±0.45)则显著提高(P<0.05),提示酸负荷下脾虚证儿童sAA糖基化异常。两组儿童AMY1基因拷贝数(脾虚证儿童：8.57±3.21,健康儿童：7.85±2.70)差异无统计学意义(17>0.05),提示AMY1基因拷贝数对脾虚证儿童sAA活性比值改变可能无影响。4.消瘦儿童酸刺激前后唾液指标变化4.1一般资料收集的49例儿童中,共有43例儿童受试者纳入研究。其中,消瘦组儿童21例,男10例、女11例,平均年龄8±2岁；健康对照组儿童22例,男13例、女9例,平均年龄8±2岁,两组儿童的年龄和性别构成无明显差异(P>0.05)。4.2消瘦儿童与健康儿童酸刺激前后唾液指标组间比较两组儿童刺激前后sAA含量和活性均无显著差异(P>0.05)。然而,消瘦儿童的sAA活性比值(1.6±0.8)相对于健康儿童(2.3±1.0)明显降低(P<0.05)；并且,消瘦儿童的sAA含量比值(1.1±0.7)相对于健康儿童(2.0±1.2)也显著降低(P<0.05),提示消瘦儿童酸负荷下的sAA分泌反应低下,与脾虚证儿童研究结果类似。另外,健康和消瘦儿童AMY1基因拷贝数平均值分别为7.6±2.7和8.0±2.1,两组儿童AMY1基因拷贝数并无显著差异(P>0.05),结果提示AMY1基因拷贝数对消瘦儿童sAA活性比值改变可能无影响。5.甜味觉差异对小鼠糖代谢及食欲等的影响5.1 B6/129和129/129小鼠甜味觉差异B6/129小鼠对2 mM糖精溶液的摄入量(7.3±0.6 ml/30 g BW)及喜好程度(91.9±1.1%)相对于129/129小鼠的摄入量(4.6±0.2 ml/30 g BW)和喜好程度(71.3±2.8%)均明显提高,差异具有统计学意义(P<0.05)；对于更高浓度糖精溶液(10mM),B6/129小鼠的摄入量(14.1±2.2 ml/30 g BW)相对于129/129小鼠(7.8±0.6 ml/30 g BW)也明显提高(P<0.05),结果提示含来源于B6的Taslr3等位基因小鼠即B6/129杂合小鼠,甜味觉病理性过高。5.2 B6/129和129/129小鼠糖代谢比较5.2.1糖耐量实验腹腔注射葡萄糖后,6-mo时基因型效应对小鼠血糖代谢的影响是显著的(P<0.05), post hoc比较发现雄性B6/129小鼠血糖在5min、45min、60 min以及90 min时均显著高于雄性129/129小鼠(P<0.05),结果表明腹腔注射葡萄糖后B6/129小鼠血糖代谢相对受损。灌胃注射后,2-mo时雄性B6/129小鼠血糖水平在灌胃注射后15 min、30 min和45 min均显著高于129/129小鼠(P<0.05)；并且,6-mo时雄性B6/129小鼠在灌胃后30 min的血糖水平也显著高于129/129小鼠(P<0.05),结果表明灌胃注射葡萄糖后B6/129小鼠血糖代谢相对受损。相对129/129小鼠,含外源性基因的B6/129小鼠腹腔及灌胃注射糖耐量均受损,符合脾虚证糖耐量异常或受损的特征。5.2.2胰岛素耐量实验注射胰岛素后,两组小鼠血糖水平开始急剧下降,并于60 min左右达到最低水平,之后开始缓慢上升,然而,小鼠血糖在120 min实验时间内并未恢复到基础值。本研究并未发现显著的基因型效应(P>0.05),结果提示两组小鼠对胰岛素敏感性相似。5.3 B6/129和129/129小鼠LabMaster比较5.3.1进食量和饮水量分析基因型效应对小鼠进食量的影响接近显著(P=0.059), post hoc比较显示：2-mo时,129/129小鼠在21：00、08：00和11：00三个时间点的进食量显著高于B6/129小鼠(P<0.05)；6-mo时,129/129小鼠在17：00(P=0.082)和18：00(P=0.070)两个时间点的进食量可能高于B6/129小鼠。研究提示,相对于129/129小鼠,B6/129小鼠的平均进食量可能更低。基因型效应对小鼠饮水量的影响是显著的(P<0.05), post hoc比较显示：2-mo时,129/129小鼠在21：00和12：00两个时间点的饮水量显著高于B6/129小鼠(P<0.05),而6-mo时,129/129小鼠在20：00和23：00两个时间点的饮水量也显著高于B6/129小鼠(P<0.05)。可见,相对于129/129小鼠,B6/129小鼠的平均饮水量显著降低。结果提示,B6/129小鼠进食和饮水量显著降低,进一步推测其更符合脾虚证特征。5.3.2呼吸交换率(RER)和能量消耗(EE)分析2-mo时,post hoc显示雄性129/129小鼠在11：00、12：00、13：00、14：00和15：00五个时间点的RER均显著高于雄性B6/129小鼠(K0.05)；6-mo时,雌性129/129小鼠在00：00、03：00和04：00三个时间点的RER均显著高于雌性B6/129小鼠(K0.05),并且,雄性129/129小鼠在14：00和15：00两个时间点的RER也显著高于雄性B6/129小鼠(P<0.05)。可见,相对于129/129小鼠,B6/129的RER显著降低。基因型效应对小鼠的EE有显著的影响,即129/129小鼠的能量消耗显著高于同年龄B6/129小鼠(P<0.05)。随着时间推移,129/129小鼠(特别是雌性)EE下降明显,而B6/129小鼠则相对稳定。可见,相对于129/129小鼠,B6/129小鼠EE水平较低,但相对稳定。结果提示,B6/129的RER及EE显著降低,能量代谢可能异常,符合脾虚证特征。5.3.3活动量分析基因型效应对小鼠活动量的影响是显著的(P<0.05),post hoc比较显示B6/129小鼠在22：00、00：00、01：00和04：00四个时间点的活动量显著高于129/129小鼠(P<0.05)。可见,相对于129/129小鼠,B6/129小鼠平均活动量更大。5.4 B6/129和129/129小鼠体重曲线和身体成分构成比较5.4.1体重曲线本研究并未发现两组小鼠体重增长有明显差异(P=0.564)。5.4.2身体成分构成分析核磁共振(NMR)分析：年龄和基因型交互作用对小鼠脂肪含量有显著影响(K0.05)。2-mmo时,B6/129小鼠脂肪含量高于129/129小鼠,随着时间推移,B6/129小鼠脂肪含量下降更明显,以致6-mo时,其脂肪含量却低于同年龄129/129小鼠。研究提示,相对129/129小鼠,B6/129小鼠脂肪含量可能更高,但随着时间推移下降相对明显。双能X线吸收测量法(DEXA)分析：GLM分析并未发现两组小鼠各DEXA指标有明显差异,但B6/129小鼠的脂肪含量有高于129/129小鼠的趋势。解剖分析： GLM分析显示,基因型效应对小鼠棕色脂肪含量有显著的影响,即B6/129小鼠的棕色脂肪含量显著高于129/129小鼠(必0.05)。结果提示,虽然两组小鼠体重增长无显著差异,但就脂肪含量来说,B6/129小鼠可能更高,特别是棕色脂肪含量,即B6/129小鼠脂代谢可能异常,亦符合脾虚证特征。结论：脾虚证儿童研究表明,患儿酸刺激后sAA活性比值下降,并伴有sAA糖基化水平异常升高,而AMY1基因拷贝数无显著变化,结果提示酸刺激后sAA活性比值测定可作为儿童脾虚证临床诊断客观参考指标之一,而sAA活性比值下降可能与其糖基化调控机制有关。消瘦儿童获得与脾虚证儿童研究的类似结果,提示脾虚是儿童消瘦的发病机制之一,同时也说明消瘦作为脾虚证的证候诊断指标之一是有科学依据的。小鼠实验研究表明,Taslr3同源异基因的B6/129小鼠甜味觉病理性过高,类似《内经》“有病口甘者”,出现糖脂代谢异常、食欲下降及能量代谢紊乱等现象,提示B6/129小鼠有应用于作为类脾虚证小鼠模型进行研究的可能,脾虚证可能存在“甜味觉-糖脂代谢”异常的发病机制。