目的：帕金森氏病是一种神经退行性病变,其病理基础之一是α-突触核蛋白的聚集。目前有研究证明,HSP70高表达可以使α-突触核蛋白成为无毒的非聚集形式。对于防止甚至逆转帕金森氏病中α突触核蛋白引起的毒性,Hsp70是一个有效的治疗靶点,而谷氨酰胺被认为可以诱导热休克蛋白表达。本研究主要是在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中,首先研究了谷氨酰胺对HSP70表达水平的影响,其次研究了谷氨酰胺提高HSP70表达中HSF-1的作用,之后构建α突触核蛋白高表达的SH-SY5Y细胞,研究谷氨酰胺在α突触核蛋白的降解中的调节作用。方法：1.在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中,研究谷氨酰胺对Hsp70表达的影响在体外和体内的实验证明谷氨酰胺能够安全地提高热休克蛋白的表达。本研究是在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中研究谷氨酰胺对热休克蛋白表达的调控,科研假设是Hsp70在α突触核蛋白的降解中起到关键的调节作用。首先,在谷氨酰胺治疗后的SH-SY5Y细胞中,通过定量PCR方法测定Hsp70表达的mRNA水平,应用蛋白印记分析(Western blot analysis)测定Hsp70蛋白表达水平。通过谷氨酰胺治疗剂量上的不同,研究不同治疗剂量的谷氨酰胺对Hsp70表达的影响。通过不同的谷氨酰胺治疗时间,研究在SH-SY5Y细胞的中,时间对Hsp70表达的影响。2在SH-SY5Y细胞中,研究谷氨酰胺引起的Hsp70上调与HSF-1之间的关系热休克因子绑定在目标序列热休克元素上,该元素位于热启动子诱导基因中促进了热休克蛋白的表达,包括Hsp70。为了明确在SH-SY5Y田胞中谷氨酰胺促进Hsp70表达的信号通路,接下来我们研究了HSF-1敲除在谷氨酰胺对Hsp70表达上的作用。在SH-SY5Y细胞中,首先采用RNAi技术敲除HSF-1的表达,之后用定量PCR检测siRNA-HSF-1转染对HSF-1mRNA水平的影响,使用Western blot技术检测siRNA-HSF-1转染对HSF-1蛋白水平的影响。3 在SH-SY5Y细胞中,研究α-突触核蛋白过表达对Hsp70和HSF-1表达的影响3.1构建α-突触核蛋白过表达的SH-SY5Y细胞克隆热休克蛋白功能缺陷被认为在PD中发挥关键作用。其中Hsp70是研究最多的分子伴侣,其在PD中负相调节α-突触核蛋白的聚集及α-突触核蛋白诱导的细胞毒性。为了探索由谷氨酰胺引起的Hsp70表达上调对α突触核蛋白的降解的影响,我们构建了一个SH-SY5Y细胞克隆,其过表达野生型α-突触核蛋白,即SH-SY5Y (SYN+)将野生型α-突触核蛋白的编码序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1 (+).通过定量PCR方法观察SH-SY5Y (SYN+)细胞中α-突触核蛋白mRNA水平的表达,通过Western blot分析检测SH-SY5Y (SYN+)细胞中α-突触核蛋白的蛋白表达水平。3.2 α-突触核蛋白过表达对HSP70和HSF-1表达的影响为了进一步探讨高表达的α-突触核蛋白对HSP70表达及HSF-1的表达是否有影响,我们通过定量PCR的方法分别对HSP70和HSF-1在mRNA水平进行了检测,并进行比较；通过Western blot的方法分别检测了HSP70和HSF-1的蛋白水平,并进行比较。4在SH-SY5Y (Syn+)细胞中,研究谷氨酰胺诱导的Hsp70对α-突触核蛋白的影响首先,在SH-SY5Y (SYN+)细胞中,通过定量PCR方法,研究谷氨酰胺对α-突触核蛋白mRNA表达水平的调控。然后在SH-SY5Y (SYN+)细胞中,使用Western blotting的方法,检测谷氨酰胺治疗后α-突触核蛋白的蛋白水平。并且为了研究谷氨酰胺剂量对α-突触核蛋白表达的影响,我们比较了4mM、8 mM和16mM的谷氨酰胺之间α-突触核蛋白的蛋白水平。此外,在SH-SY5Y (SYN+)细胞中,我们研究了给予谷氨酰胺(8mM)治疗时,HSF-1敲除对α-突触核蛋白合成的影响。结果：1.在SH-SY5Y细胞中,谷氨酰胺上调了Hsp70的表达在SH-SY5Y细胞中,首先,在谷氨酰胺治疗后,通过定量PCR方法测定了Hsp70 mRNA水平上的表达。与未治疗组相比较,谷氨酰胺(4-16 mM)治疗24小时后显著上调了Hsp70的mRNA表达水平。并且在mRNA水平上,Hsp70表达呈谷氨酰胺剂量依赖性,在4mM和8mM组之间或8mM和16mM组之间比较,Hsp70的mRNA水平有显著的差异。谷氨酰胺上调Hsp70的表达也呈时间依赖性。经12小时4mM的谷氨酰胺治疗后,Hsp70的表达是上调的,24小时后达到峰值,并且12小时治疗与24小时治疗的有明显的差别。谷氨酰胺4到16mM治疗24小时后,亦促进了Hsp70的蛋白表达水平。因此,在SH-SY5Y细胞中,谷氨酰胺上调了Hsp70的表达。2在SH-SY5Y细胞中,谷氨酰胺引起的Hsp70上调呈HSF-1依赖性采用RNAi技术沉默HSF-1表达,在SH-SY5Y细胞中,经过8mM谷氨酰胺治疗,HSF-1特异性siRNA (siRNA-HSF-1),显著下调了HSF-1的mRNA表达水平。通过转染siRNA-HSF-1,HSF-1蛋白水平也下调了。更重要的是,与siRNA control转染细胞相比,不论在蛋白表达还是在mRNA水平,Hsp70也明显下调。因此,我们确认谷氨酰胺促进Hsp70的表达是HSF-1依懒性的。3 α-突触核蛋白在SH-SY5Y细胞中过表达不影响Hsp70和HSF-1的表达3.1成功构建了一个过表达野生型α-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞克隆,即SH-SY5Y(SYN+)。将野生型-α突触核蛋白的编码序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)。α-SYN过表达的SH-SY5Y细胞克隆在含G418的完全培养基中筛选。在SH-SY5Y(SYN+)细胞中可检测到明显较高且稳定的α-突触核蛋白mRNA水平而在蛋白水平,在SH-SY5Y(SYN+)细胞中,通过Western blot分析表明α-突触核蛋白表达也明显上调。此外,α-SYN过表达在细胞传代的每一代间没有明显变化。3.2为了进一步探讨高表达的α-突触核蛋白对HSP70和HSF-1的影响,我们对Hsp70和HSF-1在mRNA水平蛋白水平的表达进行定量检测。Figure 3A-D表明Hsp70和HSF-1不论是mRNA水平还是蛋白水平,在转染cat-pcDNA3.1(+)的SH-SY5Y细胞和SH-SY5Y(Syn+)细胞之间并没有明显差别。因此,α-Syn过表达的SH-SY5Y(Syn+)细胞是稳定的,可以用以研究Hsp70对α-Syn降解的影响。4通过谷氨酰胺上调表达的Hsp70增加了α-突触核蛋白在SH-SY5Y(Syn+)细胞的降解首先,通过定量PCR,在mRNA水平研究了谷氨酰胺对α-突触核蛋白表达的调控,经过6到12小时治疗后在SH-SY5Y(SYN+)细胞中,8mM谷氨酰胺对α-突触核蛋白的mRNA水平没有影响。然后我们研究了在SH-SY5Y(SYN+)细胞中,经过谷氨酰胺治疗后的α-突触核蛋白的蛋白水平。图4B显示经谷氨酰胺治疗24小时后,降低了α-突触核蛋白的蛋白水平,与内参β-actin比较。α-突触核蛋白的减少呈谷氨酰胺剂量依赖性,在4 mM和8 mM组间有显著性差异,在8mM和16mM组之间有显著性差异。此外,HSF-1敲除后,给予谷氨酰胺(8mM)治疗,结果表明通过谷氨酰胺治疗,与对照组相比,25或50 nMsiRNA-HSF-1均抑制了α-Syn的减少。因此,我们证实,谷氨酰胺治疗促进了α-突触核蛋白在SH-SY5Y(SYN+)细胞中的降解,但是如果HSF-1敲除后,谷氨酰胺促进降解的作用就被抑制。结论：1.在SH-SY5Y细胞中,经谷氨酰胺治疗后,Hsp70的表达上调,表现在Hsp70的mRNA表达水平及蛋白水平均上调,而且在mRNA表达水平上呈现谷氨酰胺剂量依赖性及治疗时间的依赖性；2在SH-SY5Y细胞中,谷氨酰胺引起的Hsp70上调呈HSF-1依赖性；3在α-Syn过表达的SH-SY5Y(Syn+)细胞,过表达的α-突触核蛋白并不影响Hsp70和HSF-1的表达,因此,α-Syn过表达的SH-SY5Y(Syn+)细胞是稳定的,可以用以研究谷氨酰胺、Hsp70和HSF-1对α-突触核蛋白降解的影响；4通过谷氨酰胺上调的Hsp70表达增加了α-突触核蛋白在SH-SY5Y (Syn+)细胞的降解,因此可以考虑以此为靶点治疗帕金森氏病。