结直肠癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。在经济发达的美国,结直肠癌的死亡率位列恶性肿瘤中的第3位。我国结直肠癌的死亡率居于恶性肿瘤死亡率的第4-5位之间,并呈现增加的趋势。至今为止,传统的TNM分期依然是临床判断预后的金标准,仍旧没有一个可以替代它的预后标准。但TNM分期在预后评判上存在一定的缺陷,相同TNM分期的患者预后有时相差悬殊。一个完善的预后评估体系可以指导临床实践并节约医疗费用,我们认为随着一些有特色的临床和病理指标及大量分子标记在预后中作用的研究,寻求并建立一个更精确、更个性化的预后评估系统,已经是一个迫切的任务。之前,我们实验室已建立有221例结直肠癌患者的基本信息数据库。这221例患者来自萧山肿瘤登记系统中1990-2000年期间发病的患者,通过复习患者病案和H.E.切片,调查收集了比较全面的临床信息和病理信息,并已包含4个分子指标的免疫组化结果（P53、Ki67、Bcl2、CXCR4）。该数据库中已剔除术后一个月内死亡的病例和死因与结直肠癌无关的病例。所有随访信息由萧山肿瘤登记系统提供,原有数据库中的随访信息截止于2002年12月31日。我们在原有数据库的基础上,又增加了9个分子指标的免疫组化结果（NF-κB、Sydecan-1、β-catenin、CD68、PPARγ、IGF1R、IGFBP7、IR、Thymidylate Synthase）,并对随访信息进行了更新,所有随访信息更新至2007年3月31日。221例患者中结肠癌71例,直肠癌151例;男性121例、女性100例;确诊时年龄最大者85岁,最小者26岁,中位年龄为59岁;随访时间最长203个月,最短1个月,平均随访时间为92个月。TNMⅠ期35例、Ⅱ期84例、Ⅲ期80例、Ⅳ期22例;低级别癌148例、高级别癌73例;管状腺癌164例、乳头状癌26例、粘液腺癌27例、印戒细胞癌和未分化癌4例。总体1年、3年、5年、10年累积生存率分别为79%、72%、70%和67%。此221例结直肠癌患者在预后数学建模过程中被作为训练集。另外,我们又从萧山肿瘤登记系统中,选取2001-2006年期间发病的患者,进行档案资料的调查,最终获得手术医院为萧山第一人民医院的288名档案资料完整的结直肠癌患者。复习所有病案,获取临床病理资料,同时剔除术后一个月内死亡的病例,并剔除死因与结直肠癌无关的病例。所有随访信息截止于2007年3月31日。全部288例病例均经病理证实,每例选择有代表性的含肿瘤组织蜡块进行切片,行H.E.染色和免疫组织化学染色。288例患者中结肠癌167例、直肠癌121例;男性153例、女性135例;确诊时年龄最大者91岁,最小者24岁,平均年龄为64岁;随访时间最长75个月,最短1个月,平均随访时间为30个月。TNMⅠ期62例、Ⅱ期81例、Ⅲ期114例、Ⅳ期31例;低级别癌215例、高级别癌73例;管状腺癌225例、乳头状癌12例、粘液腺癌25例、印戒细胞癌和其它26例。总体1年、3年、5年累积生存率分别为84%、76%、75%。此288例结直肠癌患者在预后数学建模过程中被作为验证集。采用SPSS 16.0 for windows统计学软件（SPSS Inc.）进行以下统计学处理。用寿命表法计算累积生存率;用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析（用log-rank法进行显著性检验）,并绘制生存曲线。将单因素分析对预后有统计学意义的因素再纳入多因素COX比例风险模型进行分析。多因素COX比例风险模型采用向前逐步回归法。依据多因素COX比例风险模型结果计算每个病例的预后指数,并使用内插法计算1年、3年、5年基准死亡风险函数。从而建立基于预后指数的1年、3年、5年个体死亡风险函数的数学预测模型。采用MedCalc software 9.3.0.0（Frank Schoonjans）软件,运用ROC曲线评价预后指数在生存评判中的价值,并依据Youden指数最大的原则确定cut off值,进行预后指数分级,比较预后指数分级与传统TNM分期的预后评判价值。软件Cluster3.0（Stanford University）用于非监督系统聚类分析,采用spearman等级相关作为聚类统计量,类间归类方法采用最长距离法,结果用Treeview（Stanford University）显示。组间构成比比较采用χ²检验或Fisher’s精确检验。P值≤0.05认为有统计学意义,0.05<P值<0.1认为有可疑的统计学意义。首先单因素生存分析训练集的17个临床和病理指标、13个分子指标的预后意义。这17个临床和病理指标包括:年龄、性别、部位、组织学类型、组织学分级、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况、生长方式、脉管侵犯、神经周围侵犯、肿瘤芽、肿瘤实质淋巴细胞浸润、肿瘤间质淋巴细胞浸润、Crohn样反应、化疗、远处转移情况、TNM分期;13个分子指标分别涉及抑癌基因（P53）、凋亡（Bcl2）、增殖（Ki67）、转录因子（NF-κB）、细胞外基质受体（Sydecan-1）、细胞粘附分子（β-catenin）、巨噬细胞（CD68）、趋化因子受体（CXCR4）、核激素受体（PPARγ）、胰岛素样生长因子家族（IGF1R、IGFBP7）、胰岛素受体（IR）、和化疗（ThymidylateSynthase）。结果表明组织学类型、组织学分级、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况、生长方式、脉管侵犯、神经周围侵犯、肿瘤芽、肿瘤实质淋巴细胞浸润、肿瘤间质淋巴细胞浸润、Crohn样反应、化疗、远处转移情况、TNM分期、P53、侵袭前缘巨噬细胞计数、CXCR4前缘增强现象、IGFBP7,共18个指标具有预后意义。将这18个指标以及年龄作为校正因素纳入多因素COX比例风险模型,结果表明年龄、淋巴结转移情况、神经周围侵犯、肿瘤芽、远处转移情况、P53阳性率、IGFBP7阳性率具有独立预后意义。随后依据多因素COX比例风险模型提供的β值（回归系数）,计算每位患者的预后指数（PI）,用ROC曲线分析预后指数在预测患者1年、3年、5年生存情况中的准确性。ROC曲线分析结果显示PI值在预测1年生存情况时,选定cut off值为≤0.735,灵敏度为83.9%,特异度为72.0%,曲线下总面积（AUC）为0.833,95%可信区间（CI）为0.776-0.880,P=0.0001。根据cut off值0.735将病例分为两组,再分组进行ROC曲线分析。结果表明≤0.735组不再有统计学意义,而>0.735组具有统计学意义。>0.735组中选定cut off值为≤1.643,灵敏度为77.4%,特异度为72.2%,AUC为0.716,95%CI为0.569-0.835,P=0.0065。最后建立分级指标:PI（1年）:1:PI≤0.735;2:0.735<PI≤1.643;3:PI>1.643。依据此分级标准,给所有病例分组,作单因素生存分析,结果显示PI（1年）各级之间存在统计学差异（P值均<0.0001）。比较PI（1年）和TNM分期在评判1年生存情况时的准确性,发现在评判1年生存情况时两者无统计学差异（P=0.603）。ROC曲线分析结果显示PI值在预测3年生存情况时,选定cut off值为≤0.344,灵敏度为85.4%,特异度为67.8%,AUC为0.828,95%cI为0.772-0.876,P=0.0001。根据cut off值0.344将病例分为两组,再分组进行ROC曲线分析。结果表明≤0.344组有可疑的统计学意义,而>0.344组具有统计学意义。≤0.344组中cut off值选定为≤-0.955,灵敏度为36.3%,特异度为94.7%, AUC为0.638,95%CI为0.557-0.714,P=0.0565。>0.344组中选定cut off值为≤1.538,灵敏度为95.7%,特异度为55.0%,AUC为0.747,95%CI为0.621-0.848,P=0.0001。最后建立分级指标:PI（3年）:1:PI≤-0.955;2:-0.955<PI≤0.344;3:0.344<PI≤1.538:4:PI>1.538。依据此分级标准,给所有病例分组,作单因素生存分析,结果显示PI（3年）各级之间存在统计学差异（1级vs 3级、1级vs 4级、2级vs 4级、3级vs 4级,P值均<0.0001;1级vs 2级,P=0.0011;2级vs 3级,P=0.0008）。比较PI（3年）和TNM分期在评判3年生存情况时的准确性,发现在评判3年生存情况时两者有统计学差异（P=0.001）,PI（3年）较TNM分期更准确。ROC曲线分析显示PI值在预测5年生存情况时,结果与术后三年生存情况类似,所选定的cut off值相同,因此PI（5年）分级标准与PI（3年）一致。比较PI（5年）和TNM分期在评判5年生存情况时的准确性,发现在评判5年生存情况时两者有统计学差异（P=0.003）,PI（5年）较TNM分期更准确。之后依据多因素COX比例风险模型结果提供的基准风险函数,我们对结直肠癌患者个体1年、3年、5年死亡风险预测建立数学模型。第一步:运用内插法分别计算1年（h₁）、3年（h₃）、5年（h₅）基准死亡风险函数,计算得h₁=0.0738;h₃=0.2596;h₅=0.2930。第二步:根据h_t（x）=h_（0）texp（PI）,分别将1年、3年、5年基准死亡风险函数代入上式,可得:1年死亡风险函数H_1（x）=0.0738×exp（PI）3年死亡风险函数H_3（x）=0.2596×exp（PI）5年死亡风险函数H_5（x）=0.2930×exp（PI）以上即为最终建立的个体化时间点死亡风险预测模型,exp指以自然数e为底的指数函数,唯一可变量是PI。运用此模型可以计算每位患者的1年、3年、5年死亡风险值。还可以将此模型推广运用到各时间点的死亡风险计算。为了对所建模型进行验证,我们将验证集中的288例患者（其中2例由于取材未能取到最前缘部位,肿瘤芽无法计数,实际计算PI值286例）依据之前的β值进行预后指数的计算,并依据之前建立的预后指数分级标准进行分级。PI在判断1年生存情况时,AUC为0.944,95%CI为0.907-0.969,P=0.0001;在判断3年生存情况时,AUC为0.954,95%CI为0.908-0.981,P=0.0001;在判断5年生存情况时,AUC为0.923,95%CI为0.848-0.968,P=0.000l。以PI（1年）为标准分级后,1级者177例,2级者45例,3级者64例。单因素生存分析表明PI（1年）分级对预后有统计学意义（P<0.0001）。以PI（3年）为标准分级后,1级者39例,2级者100例,3级者82例,4级者65例。单因素生存分析表明PI（3年）分级对预后有统计学意义（P<0.0001）。P1分级在评判1年（P=0.003）、3年（P=0.042）生存情况时,较TNM分期更准确,两者有统计学差异。另一方面,非监督系统聚类分析被广泛运用于分子分型,为了比较采用不同指标进行聚类分析在生存预测上的差异,早在2007年,我们就利用221例结直肠癌患者,先后对13个免疫组化指标（13m,实为15个指标,CD68包括肿瘤主体和侵袭前缘,CXCR4包括阳性率和前缘增强现象的有无）、5个单因素生存分析有统计学意义的免疫组化指标（5m）、5个经典病理指标（5p,包括组织学类型、组织学分级、浸润深度、淋巴结转移情况、远处转移情况）、结合13个免疫组化指标和5个病理指标（13m5p）、结合5个免疫组化指标和5个病理指标进行了非监督系统聚类分析（5m5p）。结果表明只有5m5p聚类后（cluster5m5p）各组间存在统计学生存差异。我们根据聚类结果,将所有患者分成了三组:第1组包括130例患者,第2组67例患者,第3组24例患者。第1组和第2组之间生存有统计学差异（P<0.0001）,第1组和第3组之间生存有统计学差异（P=0.0146）,第2组和第3组之间生存无统计学差异（P=0.4251）。另外,5m聚类后（cluster5m）分成两组,两组间生存上有可疑的统计学意义（P=0.0532）。我们将年龄、cluster5m5p、cluster5m、TNM分期、组织学类型和组织学分级纳入多因素COX比例风险模型,分析结果显示只有5m5p聚类和TNM分期是独立的预后指标。我们将联合分子指标和病理指标进行分型称之为分子-病理分型,在预后的评估上其比分子分型更有价值。在研究过程中,我们还对微乳头结构的意义进行了观察。微乳头结构是指无中心纤维血管束的紧密排列的肿瘤细胞团,周围被裂隙样结构包绕。微乳头结构在结直肠癌中的意义目前为止还只有两篇文献,其中均未对其生存意义进行研究。221例结直肠癌中,具有微乳头结构的30例（13.6%）,无微乳头结构的191例。30例具有微乳头结构者中,微乳头结构占肿瘤面积的5%-75%。TNM分期Ⅰ期者1例（3.3%）、Ⅱ期者10例（33.3%）、Ⅲ期者18例（60.0%）,Ⅳ期者1例（3.3%）。191例无微乳头结构的结直肠癌患者中56例死亡,30例伴微乳头结构的结直肠癌患者中15例死亡,两组之间存在统计学差异（P=0.0128）。多因素COX比例风险模型结果表明微乳头结构是独立的预后指标。进一步更细致的分析发现,微乳头结构的预后意义只存在于TNM分期Ⅰ-Ⅱ期患者（P<0.0001）,而且具有独立预后意义;在TNM分期Ⅲ-Ⅳ期患者中,是否伴有微乳头结构在生存上并无统计学差异（P=0.7223）。伴有微乳头结构的结直肠癌组织学级别较高（P=0.0031）、较易发生脉管侵犯（P=0.0476）、神经周围侵犯（P=0.0242）、肿瘤芽（P=0.0096）、淋巴结转移（P=0.0281）和较高的TNM分期（P=0.0281）。进一步地分析表明,微乳头结构存在时,淋巴结转移发生率较高的现象只见于T1-2期,在T3-4期,两者并无相关性。综上所述,我们可以得出以下结论:1.在我们研究的17个临床病理指标和13个分子指标中,术后结直肠癌的独立预后因素包括:年龄、淋巴结转移情况、神经周围侵犯、肿瘤芽、远处转移情况、P53阳性率、IGFBP7阳性率;2.依据我们所建立标准计算获得的预后指数在判断结直肠癌患者术后1年、3年、5年生存情况时,具有很高的准确性;在此基础上建立的预后指数分级制较TNM分期在预后评判上有更高的准确性;3.最终建立的以预后指数为变量的1年、3年、5年死亡风险预测模型具有良好的准确性和适用性,实现了个体化生存预测;4.对结直肠癌患者,我们联合分子、病理指标进行分型,实现了分子-病理分型,在预后评判上较分子分型更有价值;5.结直肠癌中,T1-2期时,微乳头结构的存在往往伴有淋巴结转移;我们首次对微乳头结构进行生存分析,发现TNM分期为Ⅰ-Ⅱ期时,微乳头结构的存在是不利的预后指标。