早期流行病学调查表明,宫内发育迟缓(IUGR)胎儿成年后代谢综合征易感性增加,且这种易感性存在隔代遗传效应,提示代谢综合征存在一个胎儿发育起源。然而,其发生机制尚未阐明。前期研究表明,孕期吸烟可导致胎儿IUGR的发生,且IUGR胎儿成年后罹患代谢性疾病的风险增加。尼古丁是烟草的主要成分,本室前期研究发现,孕期尼古丁暴露可致胎鼠IUGR,且胎鼠存在“母源性糖皮质激素(GC)过暴露”现象。胰岛素抵抗是代谢综合征的共同病理生理基础。在成人,已证实GC是引起胰岛素抵抗最常见的激素。其机制可能与外周组织中GC代谢相关的11β-羟类固醇脱氢酶(11p-HSD)／糖皮质激素受体(GR)的特异性表达,以及胰岛素抵抗相关的代谢通路改变有关。已知在胎儿时期与胰岛素抵抗相关的代谢通路主要包括有胰岛素样生长因子(IGF)／胰岛素信号通路(如IGF-1、IGF-1R、IR、IRS、AKT、GLUT4)、脂联素信号通路(如脂联素、AdipoR、AMPK)及瘦素信号通路(如瘦素、OB-Ra、OB-Rb、AMPK)。然而,GC活化代谢与胎儿外周组织代谢编程之间的关系,至今尚未见系统的报道。基于核磁共振(NMR)的代谢组学技术可通过检测体液、细胞和组织中NMR的变化,寻找正常和病理状态下各种小分子代谢物质的异同,发现与疾病相关的差异代谢物,目前已被广泛应用于系统生物学和转化医学研究。然而,其在胎儿发育毒理学领域的应用几无研究报道。综上所述,本课题一方面通过实时定量PCR等技术研究尼古丁致IUGR胎鼠外周组织(肝脏、骨骼肌)11β-HSD／GR特异性表达模式和代谢相关信号通路的改变,另一方面通过基于NMR的代谢组学技术,研究尼古丁致IUGR胎鼠及相关生物体液(胎血、羊水及母血)的代谢组学改变,证实尼古丁所致的代谢编程改变,为阐明孕期尼古丁暴露所致代谢编程的发生机制,解析代谢综合征的胎儿发育起源,充分认识成年代谢综合征新的危险因素,指导优生优育,提供研究依据,也为进一步寻找IUGR临床早期诊断的生物标志物,提供新思路和新技术。第一部分孕期尼古丁暴露所致IUGR胎鼠代谢相关信号通路的改变目的：利用分子生物学技术,检测孕期尼古丁暴露所致IUGR胎鼠外周组织(肝脏和骨骼肌)11β-HSD-1／GR表达模式、代谢相关信号通路的改变,从代谢相关信号通路角度,证实胎鼠外周组织代谢编程的改变,并探讨其发生机制。方法：孕期大鼠于孕12日起皮下注射给予尼古丁小剂量(0.5 mg／kg),中剂量(1.0 mg／kg)和大剂量(2.0 mg／kg),每天分两次给予,每次给药容积为2 ml／kg,直至孕20日。正常对照组给予等容量的生理盐水。孕20日处死孕鼠,收集胎鼠的血浆、肝脏及骨骼肌。酶联免疫方法检测胎鼠血脂联素、皮质酮水平；实时定量PCR检测胎鼠外周组织(肝脏和骨骼肌)的GC代谢(11β-HSD-1／2、GR)、IGF类胰岛素及胰岛素通路信号蛋白(IGF-1、IGF-1R、IR、IRS-1／2、AKT、GLUT4等)、脂联素通路(AdipoR、AMPK)及瘦素通路(OB-Ra、OB-Rb、AMPK)的mRNA表达。结果：①IUGR模型建立和高GC暴露：不同剂量尼古丁处理后胎鼠的体重分别减少5.41%、9.31%和17.41%(P<0.01),IUGR发生率分别增加13.91%、25.22%和73.91%(P<0.01)；胎血皮质酮水平在中、大剂量分别增加了30%和50%(P<0.05)。②肝脏GC代谢：胎肝11β-HSD-1的mRNA表达升高,尤在大剂量组明显(P<0.05),而11β-HSD-2的mRNA表达有降低趋势,11β-HSD-1／11β-HSD-2表达比明显增加(P<0.01),同时GR的mRNA表达也剂量依赖性增加,尤在大剂量组明显(P<0.05)。③肝脏IGF类胰岛素及胰岛素通路：IGF-1及其受体IGF-1R的mRNA表达呈剂量依赖性降低(P<0.05,P<0.01)；胰岛素受体IR表达降低,以尼古丁大剂量最为明显(P<0.05)。④肝脏脂联素及瘦素通路：胎血脂联素中、大剂量分别降低了16%和15.7%(P<0.05),AdipoR呈增加趋势,AMPK呈剂量依赖性增加(P<0.01)；瘦素信号通路中OB-Ra的mRNA表达呈剂量依赖性增加(P<0.01),OB-Rb在大剂量组明显增加(P<0.05)；⑤骨骼肌GC代谢：胎骨骼肌中11β-HSD-1的mRNA表达呈升高的趋势,而11β-HSD-2的mRNA表达有降低趋势,尤以大剂量组最明显(P<0.05),11β-HSD-1／11β-HSD-2表达比明显增加。GR的mRNA表达也呈一定的升高趋势。⑥骨骼肌IGF类胰岛素及胰岛素通路：胎骨骼肌中IGF-1R的mRNA表达呈剂量依赖性降低,分别降低了37%、42%和41.5%(P<0.05,P<0.01),IRS-1大剂量明显降低(P<0.05)。结论：孕期尼古丁暴露引起的胎血高GC暴露可通过激活外周组织(肝和骨骼肌)的GC代谢(即增加11β-HSD-1／11β-HSD-2表达比和GR表达),一方面抑制IGF类胰岛素／胰岛素信号通路的功能发育,另一方面促进脂联素／瘦素信号通路的功能建立,从而使胎鼠葡萄糖和脂肪代谢编程改变,这些变化将直接减慢胎鼠的生长发育速度,引起IUGR的发生。这也可能是出生后胰岛素抵抗发生和成年后代谢综合征易感的原因。体；胰岛素样生长因子；脂联素；瘦素；信号通路第二部分孕期尼古丁暴露所致IUGR胎血、羊水及母血代谢组学改变目的：利用基于NMR的代谢组学技术,研究尼古丁致IUGR胎鼠及相关生物体液(胎血、羊水及母血)的代谢组学改变,从糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢产物改变角度,证实尼古丁所致的胎鼠外周组织代谢编程改变,并初步提出一组在母体外周中可用于反映胎儿IUGR特异性变化的小分子代谢物(即候选生物标志物)。方法：孕期大鼠于孕12日起皮下注射给予不同剂量尼古丁(0.5、1.0和2.0 mg／kg),每天分两次给予,直至孕20日。正常对照组给予等容量的生理盐水。孕20日处死孕鼠,留取胎鼠血浆、羊水及母鼠血浆,样品用EDTA抗凝,采集后立即加入NaN3(0.1%,w／v)并储藏于-80℃冰箱保存备用。样品经过一定的前处理后进行NMR实验,获得1H NMR谱,然后进行NMR数据多变量分析,包括主成分分析、正交偏最小二乘判别分析。结果：与正常对照组比较,胎血、羊水及母血各剂量组一维’H NMR谱提示代谢组出现明显改变,主要表现在糖、脂代谢及氨基酸代谢产物的改变。通过NMR数据多变量分析后发现,①胎血代谢组改变：小剂量尼古丁组升高物质有乳酸、甘油磷脂酰胆碱、N-乙酰基糖蛋白；降低有极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、磷酸胆碱、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸。大剂量尼古丁处理组引起乳酸、低密度脂蛋白、磷酸胆碱升高,而葡萄糖、极低密度脂蛋白、甘油磷脂酰胆碱、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、N-乙酰基糖蛋白降低。②羊水代谢组改变：尼古丁各剂量组乳酸、丙酮酸升高,但缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和色氨酸水平降低。③母血代谢组改变：小、中剂量尼古丁组升高的物质有乳酸、极低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、甘油磷酸胆碱、苯丙氨酸、组氨酸、N-乙酰基糖蛋白；降低的物质有低密度脂蛋白、甘油三酯、亮氨酸。另外,小剂量还导致酪氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸盐水平的升高,丙酮的降低。而中剂量则导致色氨酸、异亮氨酸的降低。大剂量尼古丁可导致升高的物质有甘油三酯、乙酰乙酸,而降低的物质有乳酸盐、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油磷酸胆碱、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、谷氨酸盐、谷氨酰胺、N-乙酰基糖蛋白。结论：孕期尼古丁暴露可导致IUGR胎儿的葡萄糖、氨基酸和脂代谢紊乱,主要表现为：①糖代谢：糖无氧酵解增强,有氧代谢减弱；②脂代谢：VLDL及LDL等脂蛋白的合成减少,甘油磷脂酰胆碱代谢紊乱；③氨基酸代谢：亮氨酸、异亮氨酸和色氨酸等必需氨基酸缺乏,谷氨酸的利用减弱,蛋白质分解代谢增强等。可能的原因为尼古丁暴露致胎儿外周组织GC代谢活化引起各代谢通路的改变,导致胎儿血代谢产物的变化。母血中代谢物(如乳酸、VLDL、LDL、甘油磷脂酰胆碱、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、N-乙酰糖蛋白)可能是反映胎儿IUGR的候选生物标志物。