丙型肝炎病毒是慢性肝病的主要病原，目前全球约有1.7亿HCV感染患者，由于缺乏有效的治疗办法，70％以上的感染者将发展成慢性感染，部分发展成肝硬化或肝癌，因此丙肝疫苗一直是近年来的研究热点。 本研究基于对DNA疫苗与RNAi技术的研究，试图开发一种治疗型的三重表达HCVDNA疫苗。疫苗载体采用美国FDA批准的新一代核酸疫苗质粒载体pVAX1，分别在载体的多克隆位点和两个非功能区域上构入抗原决定簇、hIL-12与siRNA表达单元，三个元件以各自启动子独立启动表达。为了克服病毒的高变异性，并诱导广泛而全面的抗HCV体液与细胞免疫应答，抗原采用人工设计的HCV多表位抗原基因。抗原基因与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进pVAX1的多克隆位点中，以便于在细胞水平检测抗原的表达；为了加强DNA疫苗的免疫原性，选用hIL-12作为疫苗的基因佐剂。用PCR方法先行在pVAX1上卡那霉素抗性基因与复制起始位点之间的非功能区域上引入两个酶切位点BspT Ⅰ与BshT Ⅰ，以便于将hiL-12表达单元克隆入其中；同时设计并构建8组分别针对丙肝C区、NS3区与5’-UTR区的siRNA表达单元，同时设计靶向EGFP的siRNA作为对照，以hH1启动子启动表达，克隆进载体复制起始位点下游非功能区域的Mlu Ⅰ位点上，构建三重表达的HCV DNA疫苗pVAX1-HC-EGFP-hIL12-siRNA。以此DNA疫苗转染人肝癌细胞系HepG2验证疫苗各元件在细胞水平的表达。在转染细胞中检测到绿色荧光，证实抗原表达；靶向EGFP的siRNA亦能显著抑制EGFP的表达，证实三重表达载体上的siRNA表达单元可以正常启动表达并介导RNA干扰效应；以ELISA测定细胞培养上清中hIL-12的表达，转染后48 h hIL-12的检出量为1289pg/ml细胞上清，72 h检出量为1712 pg/ml细胞上清。细胞实验初步验证了该三重表达HCV DNA疫苗内各表达单元俱能独立正常表达，证实了疫苗框架构造的可行性。 本研究成功构建了多表位抗原基因、hIL-12和siRNA共载体表达的新型丙肝DNA疫苗，并能在真核细胞中有效表达抗原基因、hIL-12并介导RNA干扰效应，为进一步研究该DNA疫苗抗HCV的免疫治疗和基因治疗效果打下基础。同时本研究提供了一种疫苗研制思路并建立一种新型DNA疫苗的可置换框架和构造平台，可应用于癌症与多种传染性疾病，具有普遍意义。