论文部分内容阅读
背景与目的:种植体周围炎和种植体周围黏膜炎作为一种常见的种植并发症,已备受临床医生关注。众所周知,导致种植体周围炎发生的始动因素是种植体颈部菌斑生物膜的积聚。因此,如何有效的清除和控制菌斑则是治疗的关键所在。近年来多种研究表明D型氨基酸(右旋氨基酸)在抑菌和破坏生物膜方面表现出良好的潜力,有望应用于控制生物膜的感染。本课题为国家自然基金中的部分研究内容,课题组前期实验已证实特定浓度(50-150mM)下的D-缬氨酸(D-valine,D-val)能有效抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成,有望将其应用于控制生物膜感染的治疗。但关于该浓度下的D-缬氨酸的细胞毒性作用及安全浓度范围还未见有明确的报道。因此,明确其生物安全性并筛选出安全浓度范围的D-缬氨酸,为其可能作为抑制生物膜形成或/和分散已形成的生物膜的制剂,治疗种植体周围炎具有重要意义。方法:1、培养小鼠成纤维L929细胞,组织学观察细胞形态及生长状态,绘制生长曲线。2、实验组分别加入不同浓度的D-val,对照组加入等体积的DMEM培养液。分别在第1、3、5天采用CCK-8法检测不同浓度的D-val对成纤维细胞L929增殖活性的影响。3、实验分组同上,于加入D-val 5天后收集细胞,Annexin V FITC/PI双染后用流式细胞术检测细胞凋亡状况。4、实验分组同上,用Quantitative Real-time PCR技术检测各组细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2和Caspase-3的相对表达量。5、采用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析,数据以均数±标准差表示,采用单因素方差分析。结果:1、CCK-8法检测结果显示,在第1,3,5天三个时间点,实验组的细胞吸光度值均低于未加入D-val组。实验组细胞的增殖活性下降,且下降的趋势呈浓度依赖性,即随着D-val浓度的增大,细胞增殖活性下降越明显。当D-val浓度在100-150mM时,细胞的增殖活性受到明显的抑制,且结果具有统计学差异(P<0.05)。2、加入D-val培养5天后,流式细胞仪检测各组中L929细胞的凋亡率,实验组的细胞凋亡率均值皆低于正常组细胞。3、qRT-PCR检测结果表明,第1天150、100、75、50mM组中Bax基因的表达量均低于对照组,且具有统计学意义(P<0.05),第5天时,实验组中150、125、100、50mM组Bax基因的表达量与对照组相比表达量也较低,且结果有统计学差异(P<0.05)。第一天150mM组中抗凋亡基因Bcl-2的表达量较对照组略有增高(P<0.05),而其余实验组125、100、75、50mM组中Bcl-2表达量则低于对照组,但结果并无统计学意义(P>0.05)。在第5天时,150mM组中Bcl-2的表达高于与对照组(P<0.05)。在第1天和5天时,150mM组中caspase-3表达量均低于对照组,且结果具有统计学意义。Bcl-2/Bax的比值结果表明,第5天时高浓度组(150、125、l00mM)中Bcl-2/Bax的比值亦高于对照组,而在50,75mM组中该比值低于对照组,但结果无统计学意义(P>0.05)。结论:1、当D-缬氨酸浓度在50至75mM时较为安全,当浓度≥100mM时D-缬氨酸对小鼠成纤维细胞L929的增殖活性表现出明显的抑制作用。2、D-缬氨酸可能在一定程度上能降低L929细胞内Bax、caspase-3等促凋亡基因的表达、上调Bcl-2/Bax值从而发挥出一定的抗凋亡作用。