论文部分内容阅读
目的:探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)是否具有MSCs的特性及经诱导后在体外能否向韧带细胞分化。方法:取产妇胎盘通过酶消化法获得h AMSCs,流式细胞术鉴定h AMSCs表型特征。取第3代h AMSCs分别加入含不同诱导液的LG-DMEM/F12培养基:A组TGF-β1+b FGF,B组透明质酸(hyaluronan,HA),C组TGF-β1+b FGF+HA,D组为空白对照组。倒置显微镜观察诱导后21 d各组细胞形态学变化;磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法检测各组细胞生长活性;诱导后7、14、21 d分别采用免疫组织化学染色及实时荧光定量PCR检测韧带特异性蛋白和基因表达。结果:流式细胞术鉴定结果表明h AMSCs表达MSCs表型。倒置相差显微镜观察示诱导21 d A、B、C组细胞均呈长梭形纤维细胞样生长,C组细胞形态更单一、有明显方向性且较A组排列更紧凑。SRB比色法检测示各组细胞于培养6 d左右达增殖高峰,6d时A、B、C组细胞活性均显著高于D组。免疫组织化学结果示:诱导培养7 d,各组均未检测到TNC表达;7、14、21 d A、B、C组Ⅰ型胶原表达均显著高于D组,14、21 d A、B、C组Ⅲ型胶原表达显著高于D组,差异均有统计学意义(P<0.001)。B组Ⅰ型胶原表达以及A、C组Ⅲ型胶原、TNC表达随时间增加均呈逐渐增高趋势,各时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.001)。实时荧光定量PCR结果示:诱导培养21 d,C组Ⅰ型胶原、TNC m RNA相对表达量显著高于A、B组,B组Ⅲ型胶原m RNA相对表达量显著高于A、C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。A、C组Ⅰ型胶原、TNC以及C组Ⅲ型胶原m RNA相对表达量随时间增加呈逐渐上调趋势,各时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.001)。结论:h AMSCs具有MSCs的特性,有良好增殖能力,经体外诱导后韧带特异性基因表达上调,韧带特异性蛋白合成增加,可作为韧带组织工程种子细胞来源之一。