两种皮氏蛾螺酶解肽抗氧化活性和ACE抑制特性研究

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高血压是影响心血管疾病发生的主要危险因素。血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE,EC 3.4.15.1)是调节血压高低的重要靶点。高血压的发生还与血管内皮功能障碍密切相关,而氧化应激导致的细胞损伤是近几年研究的重点。在外界刺激下,血管内皮细胞中的抗氧化机制受损,导致细胞内氧化稳态失衡,进而发生氧化反应。本文以两种皮氏蛾螺酶解肽(氨基酸序列为IVTNWDDMEK和VGPAGPRG)为研究对象,探讨其对于ACE两个结构域的抑制效果、构效关系、对内皮细胞氧化应激(OS)损伤的干预作用、能否激活Nrf2信号通路相关因子m RNA的表达,以及两种ACE抑制肽的稳定性,为开发预防高血压等心脑血管疾病的功能性食品提供一定理论依据。主要研究内容及结果如下:(1)通过荧光酶标仪和ACE结构域特异性荧光底物,初步确认两种酶解肽(IVTNWDDMEK和VGPAGPRG)主要是通过抑制ACE的C端结构域来抑制其酶活,抑制率分别为76.34%、39.65%(肽浓度1 mmol/L)。利用Discovery Studio软件模拟ACE和肽的作用模式,得到的结果与实验结果一致。通过傅里叶红外光谱、圆二色光谱等技术手段,初步证实两种酶解肽可以通过改变ACE酶的构象来抑制其活性。(2)通过研究两种皮氏蛾螺酶解肽对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)氧化应激(OS)损伤的干预作用、和Nrf2信号通路相关因子m RNA的表达。结果表明,两种皮氏蛾螺酶解肽分别孵育HUVECs 24 h、48 h、72 h后,对细胞无毒且能促进细胞增殖,促进NO释放,降低ET含量释放,并影响其ACE、ACE2、ET-1、e NOS m RNA的表达;可以修复H2O2细胞氧化应激损伤,有效抑制了MDA含量的增加、使SOD酶的活性降低得以恢复、抑制ROS的产生,并使Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1、SOD2和CAT的m RNA表达增加。(3)通过高效反相液相色谱技术,测定两种皮氏蛾螺酶解肽的热稳定、抗胃肠道消化吸收,抗金属离子、高盐高糖的能力,建立了ACE抑制肽的定量检测分析方法。研究结果表明,高温100℃加热6 h,多肽的稳定性明显降低,其原因可能由于长时间高温加热使肽键断裂,从而影响其生理活性。体外模拟胃肠消化研究,IVTNWDDMEK和VGPAGPRG分别在胃液2 h和肠液6 h处理后,ACE抑制率分别为30.47%、15.74%,28.01%、12.33%。多肽一定程度被分解成小分子肽段,但分解后仍具有ACE抑制活性。金属离子Zn2+和Fe3+的添加会降低ACE抑制活性,高盐高糖也会降低酶解肽的ACE抑制活性。因此,在日常生产贮存过程中,避免高温长时间加热、避免金属离子Zn2+和Fe3+的添加、降低食盐和糖的摄入,预防高血压疾病的发生。本研究为皮氏蛾螺酶解肽选择性抑制机理、保护内皮细胞氧化应激损伤、ACE抑制肽稳定性研究提供理论基础。
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