脱色酶TpmD是从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)DN322中分离纯化的、能对多种三苯基甲烷类染料进行高效脱色的新型氧化酶。为了实现脱色酶TpmD在工业上的大量生产及进行酶制剂的开发研究以应用于三苯基甲烷类染料污染环境的生物修复，本文对编码脱色酶TpmD的基因在毕赤酵母中的真核分泌表达、纯化及重组酶酶学性质进行了研究。通过tpmD基因的克隆、重组穿梭质粒的构建及电穿孔转化等一系列分子生物学操作，最终获得了能够高效分泌表达具有脱色活性TpmD酶的毕赤酵母基因工程菌株。在此基础上优化了毕赤酵母基因工程菌在实验室水平的发酵条件和重组酶TpmD的分离纯化方法，并进一步研究了各种金属离子、有机溶剂和氧化酶抑制剂对重组酶活性的影响情况，取得了以下主要结果和认识：　　 1.成功构建了能够高效分泌表达活性重组酶TpmD的重组毕赤酵母基因工程菌。通过酶切验证、菌落PCR、测序分析、甲醇诱导表达后脱色活性的测定及表达蛋白的细胞定位试验，证实外源目的基因tpmD按照预期的方式正确插入到酵母染色体上的适当位点并能够利用相连的启动调控及引导序列高效分泌表达出活性酶蛋白。　　 2.对工程菌株在发酵罐中的发酵条件进行了优化，确定重组菌株的最适发酵条件为：温度29±1℃，搅拌速率600rpm-800rpm，通气量0.8-0.9V/V·min，溶氧浓度为80％-90％饱和度，培养基初始pH为5.0±1.0，诱导甲醇量为0.5％-1％(V/V)。在最适发酵条件下发酵96h后，发酵液中酶活性最高可达到约10000U/L，而酶蛋白的产量可达100mg/L。　　 3.利用整合外源片段上的标签序列，并结合目的酶蛋白的分子量，建立了超滤管与镍离子亲和层析相结合的两步快速纯化胞外重组酶的方法和技术。该技术的纯化效率为18.27％。SDS-PAGE电泳结果表明，纯化后的重组酶TpmD有两条丰度接近但分子量稍有差别的多肽链，它们的分子量分别为37.67kDa和35.488kDa，均大于原始TpmD酶蛋白的分子量。而在非变性PAGE凝胶上，纯化的重组TpmD酶仅显示单一条带，且具有脱色活性，表明有活性的酶是此两条多肽链的二聚体。因为编码基因只有一个，它们在SDS-PAGE上的泳动差异可能是翻译后加工所致。　　 4.重组质粒pPICZαA-tpmD整合到酵母染色体后具有良好的传代稳定性。传代试验表明，传100代以上后，与tpmD基因相连的抗性基因稳定性仍为100％。重组酶稳定性实验表明纯化的重组酶TpmD在常温下放置35天后仍保持70％以上酶活性。　　 5.研究各种金属离子、有机溶剂和抑制剂对重组酶活性的影响，结果表明Li+对TpmD酶活性无明显影响，Na+，Mg2+，K+，Ba2+轻微抑制酶活性，Zn2+，Cu2+，Mn2+，Ca2+，Fe3抑制作用较强，Al3+完全抑制酶活性。有机溶剂中甲醇对酶活性抑制作用较弱，乙醇和丙酮则使重组酶活性迅速丧失。低浓度二甲基亚砜有利于维持重组酶的活性，30％的二甲基亚砜可抑制一半以上酶活性。L-半胱氨酸、叠氮化钠及低浓度的EDTA对重组酶活性影响较小，较高浓度的EDTA则显示较强抑制作用；极低浓度的表面活性剂SDS能够完全抑制重组酶活性。　　 6.抗氧化剂二硫苏糖醇(DTT)对重组脱色酶的作用十分独特，深入研究发现DTT可替代NADH辅助脱色反应并增加脱色速率，且酶促脱色反应过程中溶氧浓度及脱色产物与NADH作为辅酶时明显不同，是一种催化机理与NADH作为辅酶原理完全不同的全新的脱色反应。