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目的胰腺导管腺癌是世界上最致命的恶性肿瘤之一,其5年总生存率大约为8%。由于在疾病早期缺乏特异性症状,当被诊断为PDAC时,有80%至85%的患者失去了手术机会[1-2]。对于这些无法切除的PDAC患者,化学疗法（主要是基于吉西他滨和吉西他滨的组合）是必不可少的[3-4]。GEM是嘧啶类抗代谢物,二磷酸（d Fd CDP）和三磷酸核苷（d Fd CTP）是其在抗肿瘤过程中产生的活性代谢物,可以在细胞内造成DNA损伤,从而通过抗增殖及促凋亡引起肿瘤死亡。然而,他们中大多数人的预后非常差,这与在化疗过程中产生耐药性密不可分,统计发现出现化学耐药性的总生存期不到1年[5-6]。因此,阐明PDAC化疗耐药的分子机制被认为是改善患者预后的重要途径。PDAC化疗耐药的诱因十分复杂。目前研究表明其可能主要与细胞凋亡[7]、EMT[8]、表观遗传学改变及胰腺癌干细胞（PCSCs）的形成密切相关[9]。DDR能力异常激活和增强是导致癌细胞对化疗药物产生耐药性的重要基础。课题组前期研究发现LncRNA ANRIL通过促进EMT行为在PDAC的发生发展中扮演了重要的角色,PRC家族在一些肿瘤中参与了DDR[10],EZH2和Ring1B可以聚集到DNA损伤的部位从而促进修复。近年来随着RNA-Seq技术的广泛应用,LncRNA已经成为研究热点之一,其在肿瘤的发生、发展中的研究逐渐引起国内外研究者的重视[11]。LncRNA可以起到支架的作用,组织蛋白复合物行使生物学功能。本研究深入探讨LncRNA ANRIL联合PRC蛋白促进PDAC细胞吉西他滨耐药的作用和机理,以及三者在化疗性DNA损伤修复过程中的相互作用机制,为PDAC的治疗提供新靶点、新策略。方法1 ANRIL在Panc-1-GR/Bxpc-3-GR细胞中过表达通过采用体外GEM物浓度逐渐递增及间断联合大剂量冲击的方法诱导出了耐GEM的胰腺癌细胞株Panc-1-GR和Bxpc-3-GR;蛋白免疫印迹检测了Panc-1-GR/Panc-1,Bxpc-3-GR/Bxpc-3中E-cadherin和Vimentin的表达情况;将细胞用不同浓度的GEM孵育48h,使用Cell Counting Kit-8试剂根据制造商的方案进行生长抑制测定,得到Panc-1-GR/Panc-1,Bxpc-3-GR/Bxpc-3细胞的IC50值;使用与ANRIL的一部分互补的锁定核酸（LNA）探针检测Panc1-GR/Panc-1细胞中ANRIL的表达;RT-PCR检测Panc-1-GR/Panc-1细胞中ANRIL的表达。2 ANRIL促使胰腺癌对吉西他滨耐药性增强使用基因敲减技术成功构建出了ANRIL敲减的稳转细胞株;RT-PCR检测ANRIL的表达与GEM药物浓度的关系;生长抑制试验检测ANRIL敲减后PDAC细胞对GEM的敏感性;克隆形成实验检测ANRIL敲减后对PDAC细胞增殖的影响;蛋白免疫印迹检测ANRIL敲减后GEM对PDAC细胞DNA损伤的影响,彗星实验、激光共聚焦检测ANRIL敲减后PDAC细胞DNA损伤及修复情况。3 ANRIL联合PRC通过增强胰腺癌细胞DDR从而促进化疗耐药RIP及蛋白质免疫共沉淀实验验证了ANRIL可以与Ring1B及EZH2发生特异性结合;克隆形成实验及生长抑制实验检测Ring1B和EZH2敲减后Panc-1细胞对GEM的敏感性及增殖能力;蛋白免疫印迹检测Ring1B和EZH2的表达情况与GEM药物浓度的关系,以及Ring1B和EZH2敲减后Panc-1细胞的DNA损伤情况;彗星实验、激光共聚焦检测Ring1B和EZH2敲减后Panc-1细胞DNA损伤及修复情况。4 ANRIL联合PRC通过调控RAD51、BRCA从而增强胰腺癌细胞的DDRRT-PCR检测Panc-1-GR/Panc-1,Bxpc-3-GR/Bxpc-3及分别敲减ANRIL、Ring1B、EZH2后HR和NHEJ修复通路中BRCA、RAD50、RAD51、MRN、XRCC2、KU70、KU80 m RNA的表达情况;蛋白免疫印迹检测敲减ANRIL、Ring1B、EZH2后BRCA、RAD50、RAD51的表达情况。结果1构建耐吉西他滨的胰腺癌细胞株Panc-1-GR/Bxpc-3-GRPanc-1-GR的GEM IC50值是Panc-1的10倍,Bxpc-3-GR的GEM IC50值是Bxpc-3的8倍,Panc-1-GR、Bxpc-3-GR中Vimentin均出现上调,E-cadherin均出现下调。2 ANRIL促使胰腺癌对吉西他滨耐药性增强与Panc-1、Bxpc-3相比,Panc-1-GR、Bxpc-3-GR中ANRIL的表达量明显升高;随着GEM药物浓度的增加,ANRIL的表达量也在逐渐升高;敲减ANRIL后,Panc-1-GR、Bxpc-3-GR细胞对GEM表现出更强的敏感性;敲减ANRIL后,GEM对胰腺癌细胞造成更严重的DNA损伤和表现出更弱的DNA修复能力。3 ANRIL联合PRC通过增强胰腺癌细胞DDR从而促进化疗耐药ANRIL可以与Ring1B发生特异性结合;分别敲减EZH2、Ring1B后,胰腺癌细胞对GEM更敏感,并且造成DNA损伤更强,修复能力明显减弱,增殖能力也明显下降。4 ANRIL联合PRC通过调控RAD51、BRCA从而增强胰腺癌细胞的DDR分别敲减ANRIL、EZH2、Ring1B后,BRCA1、BRCA2、RAD51的表达量明显下降。结论LncRNA ANRIL可以联合EZH2、Ring1B共同促进胰腺癌GEM的化疗耐药,三者通过上调HR通路中的BRCA1、BRCA2、RAD51。当胰腺癌细胞接受GEM治疗时,协同增强胰腺癌细胞的DNA修复能力,抑制了随后发生的细胞凋亡,使胰腺癌细胞对GEM的治疗不敏感。本研究为PDAC的治疗提供了新靶标,也为胰腺癌使用GEM治疗的预后提供了新的生物标志物,同时为PDAC患者GEM化疗耐药提供了新的理论依据。